一种连接非依赖克隆接头序列和应用制造技术

本发明专利技术公开了用于连接非依赖的克隆技术(LIC)得接头序列，其中该接头序列为：上游序列：GCA GCA GGA GGC GG所示的核苷酸序列；和下游序列：CCG CCA CCA GCA GC所示的核苷酸序列。利用本发明专利技术序列，将该接头序列连接入质粒载体后形成的新的载体，可以实现目的片段的连接非依赖克隆，减少融合蛋白性质的变化。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程领域，具体的说，本专利技术涉及一种用于连接非依赖克隆(ligationindependentcloing,LIC)的接头序列。
技术介绍
采用限制性内切酶进行酶切、DNA连接酶连接构建质粒载体的方法受到酶切位点的序列、排列方式、方向等的限制。连接非依赖的克隆技术(LIC)利用DNA聚合酶的外切活性，在目的载体和插入片段产生DNA5’-端较长的单链粘性末端，通过碱基互补配对形成带有切刻的环状DNA，转化大肠杆菌后，在细菌细胞内修复成为无切刻的质粒DNA，从而完成目的片段的克隆。LIC技术可以克服酶切连接克隆的限制，目的片段不受载体酶切位点的影响，克隆效率高，适用于高通量的克隆。连接非依赖克隆的关键之一在于接头序列的设计，目前已知的接头序列会在所表达的融合蛋白中添加稀有氨基酸残基或者化学性质差异较大，如酸性、碱性、容易被磷酸化的氨基酸残基等。由于质粒载体多用于目的蛋白的表达，因此接头序列应尽量避免引入稀有氨基酸残基、带电荷氨基酸残基等，以保证蛋白质性质不发生显著变化。
技术实现思路
为了解决先前的技术问题，本专利技术提供一种新的LIC接头序列，该序列编码多肽仅含化学性质稳定，分子量较小的甘氨酸和丙氨酸残基，可以克服现有技术中的缺陷，避免引入稀有氨基酸残基、带电荷氨基酸残基等。本专利技术的用于连接非依赖克隆(ligationindependentcloing，LIC)序列，将该接头序列连接入质粒载体后形成的新的载体，可以实现目的片段的连接非依赖克隆，在后续表达的融合蛋白中仅掺入甘氨酸、丙氨酸残基，不会掺入稀有氨基酸残基、带电荷氨基酸残基等。一方面，本专利技术提供一对接头序列，其中该接头序列包括包括：上游序列：GCAGCAGGAGGCGG(SEQNO.8)所示的核苷酸序列；和下游序列：CCGCCACCAGCAGC(SEQNO.9)所示的核苷酸序列。优选的，利用该接头序列作为连接非依赖克隆的接头序列。优选的，该接头序列包括载体接头序列和与目的基因连接的接头序列，所述的载体的接头序列为如下序列：gcTGCAGCAGGAGGCGGgccc(SEQNO.10)；和序列TCCGCCACCAGCAGCgggccc(SEQNO.11)。优选的，所述的与目的基因连接的序列为：GCAGCAGGAGGCGGT和序列CCGCCACCAGCAGCTCC。一种所述的接头序列在连接非依赖克隆方面的应用，其中,所述的接头序列为上游序列和下游序列，其中上游序列为GCAGCAGGAGGCGG所示的核苷酸序列；下游序列为CCGCCACCAGCAGC所示的核苷酸序列。一种所述的接头序列在连接非依赖克隆方面的应用，其中，与载体连接的序列对为：gcTGCAGCAGGAGGCGGgccc和TCCGCCACCAGCAGCgggccc；其中，与目的基因连接的序列对为GCAGCAGGAGGCGGT(SEQNO.12)和序列CCGCCACCAGCAGCTCC(SEQNO.13)。有益效果利用本专利技术序列，将该接头序列连接入质粒载体后形成的新的载体，可以实现目的片段的连接非依赖克隆，减少融合蛋白性质的变化。附图说明图1为本专利技术具体实施例子中所用的载体质粒的主要结构示意图。图2为本专利技术一个具体实施方式中利用本专利技术的接头序列进行外源基因表达蛋白的载体接头序列和目的基因接头序列的具体序列图谱。图3为LIC技术的主要技术路线示意图。图4为pJP638的部分序列图，其中下划线的是本专利技术的接头序列。图5是pJP638-Nbpin1的序列图，其中下划线的是本专利技术的接头序列。详细说明连接非依赖的克隆技术(LIC)利用DNA聚合酶的外切活性，在目的载体和插入片段产生DNA5’-端较长的单链粘性末端，通过碱基互补配对形成带有切刻的环状DNA，转化大肠杆菌后，在细菌细胞内修复成为无切刻的质粒DNA，从而完成目的片段的克隆(例如图3所示的LIC技术的基本技术路线图)。LIC技术可以克服酶切连接克隆的限制，目的片段不受载体酶切位点的影响，克隆效率高，适用于高通量的克隆。LIC技术一般主要包括一下步骤(图3)：1.1构建LIC载体(LICvector)：采用含有接头(例如本专利技术的licl3,licl4)的引物扩增ccdb基因，并利用酶切连接克隆进入目标载体的多克隆位点，形成LIC载体。1.2目的基因的扩增：采用含有接头(licl3,licl4)的引物PCR扩增目的基因(Gene)，形成插入片段(Insert)，该目的基因可以是任何想要的基因序列，包括植物、动物或者哺乳动物中的某些特异的基因片段或者基因序列。1.35’-粘性末端的形成：采用Apa1酶切LIC载体，切除ccdb基因，采用T4DNA聚合酶(T4DNAPolymerase)处理，利用T4DNA聚合酶3’-5’外切核酸酶活性产生5’粘性末端；同样采用T4DNA聚合酶处理带有接头序列的目的基因PCR扩增产物，产生5-粘性末端。1.4目的载体(Resultedvecotr)形成：将经过T4DNA聚合酶处理的LIC载体和插入片段混合后，通过碱基互补配对，形成带有切刻的环状质粒。共同转化大肠杆菌(E.coli)感受态细胞，二者在大肠杆菌体内完成切刻修复，形成完整的目的载体。通过以上技术路线，可以实现外源基因的转移和表达，在此技术路线中，接头序列显得比较重要，因为接头序列直接关系到目的基因所编码蛋白的性质，因为通常蛋白具有固有的性质，例如酸性或者碱性蛋白，由于在蛋白的表达过程中，接头序列也会编码蛋白，从而形成融合蛋白，为了让表达的目的蛋白和原始自然的蛋白的性质相同或者近似，常常尽可能的不影响目的蛋白的性质，采用这样的方法有多种，例如表达的过程的调控，例如通过表达参数的设置、或者表达后对目的蛋白的纯化条件的设置等来尽量让目的蛋白具有应有的活性。本专利技术小组发现，通过对接头序列的设置，也可以使通过载体表达的蛋白活性保持不变，因为本专利技术的序列所编码的蛋白基本为中性的，无论目的蛋白是酸性还是碱性的，都不影响目的蛋白本身的性质。一旦设计好该接头序列，至于该接头序列前面是否还要连接其它的序列，可以根据情况而定，一般包括两个功能，即该序列与所转化的质粒载体进行连接，另一是该接头序列与目的基因连接。因此，与质粒载体连接的接头序列之一的前端(5’端)还可以包括保护碱基(例如，序列gcc)或者酶切位点(例如：gagctc)的基因，在该接头序列后端(3’端)包括酶切位点和/或者致死基因，例如ccdb基因。同样，与质粒载体连接的接头序列的另一段序列的前端(5‘端)还可以包括保护碱基(例如序列ccc)或者酶切位点的基因(例如ggtacc)，在该接头序列后端(3’端)包括酶切位点和致死基因的反向互补基因序列。优选的，与载体连接的接头序列如下所示：：(5’)gcc-gagctc-ACCATGgc-TGCAGCAGGAGGCGG-gccc-TCACAAGTTTGTACAAAAAAGCT(3‘SEQNO：1)保护碱基-酶切位点-翻译起始序列-licl3接头序列-Apa1酶切位点+ccdb基因5’序列ccc-ggtacc-TCCGCCACCAGCAGC-gggccc-CAACCACTTTGTACAAGAAAGCTG(SEQNO：2)保护碱基-酶切位点-licl4接头本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于非依赖的克隆技术(LIC)的接头序列，其中该接头序列为：上游序列GCA GCA GGA GGC GG所示的核苷酸序列；和下游序列CCG CCA CCA GCA GC所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
2016.06.22 CN 20161045525181.用于非依赖的克隆技术(LIC)的接头序列，其中该接头序列为：上游序列GCAGCAGGAGGCGG所示的核苷酸序列；和下游序列CCGCCACCAGCAGC所示的核苷酸序列。2.用于非依赖的克隆技术(LIC)的接头序列，其中，该接头序列包括与载体连接的序列对和，其中，与载体连接的序列对为：gcTGCAGCAGGAGGCGGgccc和TCCGCCACCAGCAGCgggccc。3.根据权利要求2所述的接头序列，其中，该接头序列还包括与目的基因连接的序列，与目...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵晋平，冀梦菲，燕飞，程晔，陈剑平，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33