一种Sn‑1,3专一性固定化脂肪酶的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种Sn‑1,3专一性固定化脂肪酶的制备方法，包括如下步骤：S1.对大孔树脂进行预处理去除杂质；S2.将脂肪酶溶解于缓冲液中，离心取上层清液，即为酶液；S3.取步骤S1得到的酶液，加入步骤S1预处理好的大孔树脂，振揺，抽滤，洗涤，干燥，得到固定化脂肪酶；其中，所述大孔树脂包括非极性大孔吸附树脂A和弱极性大孔吸附树脂B。该方法所制得的固定化酶固定化率可达93%~97%，酶活回收率可达98%~118.9%。通过酶学性质研究发现，本发明专利技术得到固定化脂肪酶具有较好的酯化活力和高的Sn‑1,3专一性，催化酯化率可达96%以上，同时具有较好的操作稳定性，可重复使用50次。

A preparation method of Sn 1,3 specificity of immobilized lipase

The invention discloses a preparation method of Sn 1,3 specificity of immobilized lipase, which comprises the following steps: S1. impurity removal pretreatment of macroporous resin; S2. lipase dissolved in buffer solution, centrifuged supernatant, the enzyme solution; S3. enzyme solution obtained in step S1, add step S1 resin, good vibration rolling pretreatment, filtration, washing, drying, by immobilized lipase; wherein, the macroporous resin including nonpolar macroporous adsorption resin A and weak polar macroporous adsorption resin B. The immobilized enzyme immobilized by this method can reach 93%~97%, and the recovery rate of the enzyme can reach 98%~118.9%. Through the characterization of the study found that the immobilized lipase has good esterification activity and high Sn 1,3 specificity, catalytic esterification rate is above 96%, and has good stability, can be used repeatedly for 50 times.

【技术实现步骤摘要】
一种Sn-1,3专一性固定化脂肪酶的制备方法
本专利技术涉及脂肪酶固定化
，更具体地，涉及专利技术名称一种Sn-1,3专一性固定化脂肪酶的制备方法。
技术介绍
脂肪酶是一类特殊的酰基水解酶，作为生物催化剂时，既可在油水界面上催化酯水解反应（ROOR*+H20→→RCOOH+R*OH），又可催化合成反应，包括酯化（RCOOH+R*OH→→ROOR*+H20）、酯交换（RCOOR*+R#COOR→→ROOR+R#COOR*）、醇解（RCOOR*+R#OH→→ROOR#+R*OH）和酸解（RCOOR*+R#COOH→→R#COOR*+RCOOH），基于此，它是一种重要的工业酶制剂。游离脂肪酶在使用过程中容易存在如下缺陷：①酶的价格昂贵，只能使用一次，使用成本高；②在非水体系中不溶解，反应过程中容易聚集，影响酶活；③容易受外界因素（如温度、pH值等）改变而失活。如果将脂肪酶固定化，不仅可以提高酶的稳定性，而且易于分离、可使用连续使用、降低生产成本。国内外大量的研究表明，油脂中三酰甘油的1,3位和2位的脂肪酸对油脂的理化、营养和生理特性方面有较大的差异，其中以1,3位功能性最佳。由于Sn-1,3位专一性脂肪酶选择性地水解三酰甘油的1位和3位，被广泛的用于生产结构脂质、母乳脂肪替代品、类可可脂和甘油二酯等，因此获得价格低廉而活性高的酶、高效的酶固定化技术和研发酶反应器是今后研究的重点。目前国内外常见的Sn-1,3专一性脂肪主要有丹麦Novozyme公司的三种商品化脂肪酶LipozymeRMIM（菌种来源Rhizomucor．miehei）、LipozymeTLIM（菌种来源Thermomyces．lanuginosus）、LipozymeRMIM（菌种来源Candida．antarctica），其存在使用成本高的特点；国内也有研究利用Aspergillusoryzae发酵的脂肪酶进行固定化并应用于OPO合成中（李阳，2015，Sn-1,3专一性脂肪酶的固定化及其在结构油脂OPO合成中的应用）。检索相关专利发现，国内未检出专门用于Sn-1,3专一性脂肪的专利，目前公开的CN201310495368.5、CN201410614900.5、CN201410263491.9、CN201410534346.X等均是介绍以磁性微球、改性材料、天然多孔材料、各类凝胶、合成树脂等单一载体进行脂肪酶的固定化，但也存在载体制备工艺较复杂，载体一般不可回收的问题。而且目前少有提高固定化脂肪酶活性的方法研究，ZL101736000B-提高固定化脂肪酶活性和稳定性的方法中介绍了一种选用醇、酮、酯处理剂来提高酶活性和稳定性，但是在固定化脂肪酶由于使用多为有机溶剂，存在一定的使用安全性。如何简易的在固定化过程中提高固定化脂肪酶的活性也是降低固定化脂肪酶成本和提高其实用性的突破口。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术为克服上述现有技术所述的至少一种不足，提供一种具有Sn-1,3位专业性的固定化脂肪酶的制备方法，选用Sn-1,3位酯化活性高的游离脂肪酶粉A03进行固定化，解决游离酶粉使用次数少、成本高，不易从反应体系中分离等问题，以期将其广泛应用与甘油二酯、OPO等结构脂质的生产应用中。为了解决上述存在的技术问题，本专利技术采用下述技术方案：一种Sn-1,3专一性固定化脂肪酶的制备方法，包括如下步骤：S1.对大孔树脂进行预处理去除杂质；S2.将脂肪酶溶解于缓冲液中，离心取上层清液，即为酶液；S3.取步骤S1得到的酶液，加入步骤S1预处理好的大孔树脂，振揺，抽滤，洗涤，干燥，得到固定化脂肪酶。其中，所述大孔树脂包括非极性大孔吸附树脂A和弱极性大孔吸附树脂B。进一步地，所述非极性大孔吸附树脂包括MA-NP6、MI-BN4、MI-300IDA、LX-1000EP、GDX-104、LX-1000HA、LX-EP120、LX-EP130、LX-201A、SD300、DM11、D354、D730、SIP1100、SIP1200中的至少以一种；所述弱极性大孔吸附树脂包括MI-WP8、GDX-501、D201、D301、HPD400、HPD500、DowexA-1、D401、DiaionCR-10、LSC-100、LSC-200中的至少一种。进一步地，所述大孔树脂中非极性大孔吸附树脂与弱极性大孔吸附树脂的质量比为1:1~1:2。进一步地，所述脂肪酶与大孔树脂的质量比为1:0.5~1:2，最优选脂肪酶与大孔树脂的质量比为1:0.5~1:1。进一步地，步骤S1中，大孔树脂预处理包括：先后用乙醇、酸、碱浸泡去除杂质，最后水洗至中性，低温下保存待用。进一步地，步骤S2中，所述缓冲液为Tris－HCl、巴比妥钠－HCl、硼酸-硼砂、柠檬酸-柠檬酸钠、磷酸盐缓冲液中的一种或多种，其中以磷酸盐缓冲液效果最佳。所述缓冲液的pH值为5.0~9.0。进一步地，步骤S3中，脂肪酶的固定化温度为25~40℃，固定化时间为4~10h。Sn-1,3专一性脂肪酶的固定化，具体由包括以下步骤的方法制成：（1）Sn-1,3专一性脂肪酶筛选：以甘油、油酸为底物，加入一定量的脂肪酶于反应器中，在各自适合的温度下，边抽真空边搅拌进行反应，用薄层色谱法和气相色谱测定其中1,3-甘油二酯的含量，筛选出1,3-甘油二酯生成含量高的脂肪酶即为目标Sn-1,3专一性脂肪酶。（2）Sn-1,3专一性脂肪酶固定化：S1.树脂预处理：取一定量的大孔树脂A、B用95wt%乙醇浸泡4~12h，期间搅拌数次，真空抽滤去除洗涤液，再用蒸馏水反复多次洗涤至无明显乙醇气味，用2~5wt%盐酸溶液浸泡2~4h后水洗至中性，再用1~2wt%氢氧化钠浸泡2~4h后水洗至中性，抽滤去除水分后低温保存备用。S2.酶液制备：取脂肪酶，加入pH5.0~9.0缓冲液于25~40℃，搅拌1h使其充分溶解，然后4000r/min离心10min，取上层清液即为酶液，通过考马斯亮蓝法测定其蛋白含量。S3.脂肪酶的固定化：取100mL酶液，加入10g（湿基）预处理好的大孔树脂（A、B两种树脂添加比例为1:1~1:2），于25~40℃恒温水浴摇床中150r/min振揺吸附4~10h，吸附结束后抽滤去掉剩余酶液，干燥即得固定化脂肪酶。作为优化，步骤S1中，所述盐酸溶液的浓度优选2wt%，氢氧化钠溶液的浓度的优选2wt%。作为优化，步骤S2中，缓冲液离子强度为0.025M~0.075M，pH范围在5.0~9.0。作为优化，步骤S3中，干燥方式可为冷冻干燥（-40℃，2~4h）、真空干燥（40~50℃、2~5h）、热风干燥（50~60℃，2~5h）。本专利技术还提供一种金属离子溶液络合处理制备高活力固定化脂肪酶的方法，包括Sn-1,3专一性固定化脂肪酶的制备方法中的各步骤，其中，步骤S1中，大孔树脂的预处理包括用含Ca2+、K+、Ba2+中一种或多种的金属离子溶液络合处理。进一步地，所述金属离子溶液为CaCl2、CaCO3、KCl、KNO3、BaCl2、BaSO4中的至少一种。进一步地，所述金属离子溶液的离子强度为0.02~0.05M。金属离子溶液络合处理制备高活力固定化脂肪酶的方法，具体步骤如下：（1）树脂预处理：取一定量的大孔树脂A、B用95wt%乙醇浸泡4~1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种Sn‑1,3专一性固定化脂肪酶的制备方法，包括如下步骤：S1.对大孔树脂进行预处理去除杂质；S2.将脂肪酶溶解于缓冲液中，离心取上层清液，即为酶液；S3.取步骤S2得到的酶液，加入步骤S1预处理好的大孔树脂，振揺，抽滤，洗涤，干燥，得到固定化脂肪酶；其特征在于，所述大孔树脂包括非极性大孔吸附树脂和弱极性大孔吸附树脂。

【技术特征摘要】
1.一种Sn-1,3专一性固定化脂肪酶的制备方法，包括如下步骤：S1.对大孔树脂进行预处理去除杂质；S2.将脂肪酶溶解于缓冲液中，离心取上层清液，即为酶液；S3.取步骤S2得到的酶液，加入步骤S1预处理好的大孔树脂，振揺，抽滤，洗涤，干燥，得到固定化脂肪酶；其特征在于，所述大孔树脂包括非极性大孔吸附树脂和弱极性大孔吸附树脂。2.根据权利要求1所述的Sn-1,3专一性固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，所述非极性大孔吸附树脂包括MA-NP6、MI-BN4、MI-300IDA、LX-1000EP、GDX-104、LX-1000HA、LX-EP120、LX-EP130、LX-201A、SD300、DM11、D354、D730、SIP1100、SIP1200中的至少以一种；所述弱极性大孔吸附树脂包括MI-WP8、GDX-501、D201、D301、HPD400、HPD500、DowexA-1、D401、DiaionCR-10、LSC-100、LSC-200中的至少一种。3.根据权利要求1或2所述的Sn-1,3专一性固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，所述大孔树脂中非极性大孔吸附树脂与弱极性大孔吸附树脂的质量比为1:1~1:2。4.根据权利要求1或2所述的Sn-1,3专一性固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，所述脂肪酶与大孔树脂的质量比为1:0.5~1:2。5....

【专利技术属性】
技术研发人员：刘放，曹庸，戴伟杰，黄匆，
申请(专利权)人：广东惠尔泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44