一种玉米RNA聚合酶III识别的启动子及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种玉米RNA聚合酶III识别的启动子及其应用。本发明专利技术的启动子ZmPolⅢca99是下述a)或b)或c)的DNA片段：a)SEQ ID No.1所示的DNA分子；b)与a)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA分子；c)在严格条件下与a)或b)限定的DNA序列杂交，且具有启动子功能的DNA分子。本发明专利技术的启动子ZmPolⅢca99是可以启动sgRNA编码基因转录的启动子，是RNA聚合酶III识别的启动子(RNA聚合酶III启动子)，能够参与CRISPR/Cas9系统的基因组编辑，在植物育种中具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
一种玉米RNA聚合酶III识别的启动子及其应用
本专利技术涉及基因工程领域中一种玉米RNA聚合酶III识别的启动子及其应用。
技术介绍
RNA聚合酶是以一条DNA链或RNA链为模板催化核苷-5’-三磷酸生物合成RNA的酶，该类酶以模板为指导，以三磷酸核糖核苷为底物，通过磷酸二酯键聚合合成RNA。玉米等真核生物中，依据RNA聚合酶产物的不同，可以分为三类，分别为RNA聚合酶I、II和III。RNA聚合酶III(PolIII)主要负责转录snRNA，如5srRNA等小分子RNA。PolIII可以在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成RNA，遇到4-5个连续的U即终止，可以准确高效的产生小片段RNA。启动子是一段位于结构基因5'端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性。因为基因的特异性转录取决于酶与启动子能否有效地形成二元复合物，故RNA聚合酶如何有效地找到启动子并与之相结合是转录起始过程中首先要解决的问题。CRISPR/Cas9是基于细菌或古细菌规律成簇的间隔短回文重复CRISPR(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)介导的获得性免疫系统衍生而来的基因编辑技术，该技术通过RNA碱基互补配对识别DNA，指导Cas9蛋白切割识别的双链DNA，诱发同源重组(HDR，homologousdirectedrepair)或非同源末端链接(NHEJ，non-homologousend-joining)，进而实现目的DNA编辑。基于细菌II型免疫机制开发的基因编辑技术在植物，特别是作物遗传改良上具有重大的应用前景，该技术的基本要求之一就是受体细胞内表达单分子识别RNA(sgRNA,singleguidingRNA)，该分子负责识别特异性的基因编辑位点，然后介导结合Cas9蛋白行使DNA酶切活性，在设计的位点引入DNA双链断裂损伤，通过胞内的NHEJ或HDR修复途径引入突变。因此，sgRNA的表达是该技术的重要组成部分。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种玉米RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子。本专利技术所提供的一种RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子，名称为ZmPolⅢca99，来源于玉米(ZeamaysL.)，是下述a)或b)或c)的DNA片段：a)SEQIDNo.1所示的DNA分子；b)与a)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA分子；c)在严格条件下与a)或b)限定的DNA序列杂交，且具有启动子功能的DNA分子。上述启动子中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次。每次5min0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次。每次15min。上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％、95％以上的同一性。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本专利技术的启动子核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本专利技术分离得到的启动子核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要保持了表达靶基因的启动子活性，均是衍生于本专利技术的核苷酸序列并且等同于本专利技术的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本专利技术的启动子核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了含有上述RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子ZmPolⅢca99的生物材料。本专利技术所提供的含有上述RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子ZmPolⅢca99的生物材料，为下述B1)至B6)中至少一种：B1)含有上述RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子ZmPolⅢca99的表达盒；B2)含有上述RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子ZmPolⅢca99的重组载体、或含有B1)所述表达盒的重组载体；B3)含有上述RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子ZmPolⅢca99的重组微生物、或含有B1)所述表达盒的重组微生物、或含有B2)所述重组载体的重组微生物；B4)含有上述RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子ZmPolⅢca99的转基因植物细胞系、或含有B1)所述表达盒的转基因植物细胞系；B5)含有上述RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子ZmPolⅢca99的转基因植物组织、或含有B1)所述表达盒的转基因植物组织；B6)含有上述RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子ZmPolⅢca99的转基因植物器官、或含有B1)所述表达盒的转基因植物器官。上述生物材料中，B2)所述重组载体可含有sgRNA编码基因，上述RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子ZmPolⅢca99启动所述sgRNA编码基因的转录。上述生物材料中，B2)所述重组载体具体可为重组载体pCas9-ZmPolⅢca99-sgRNA，其核苷酸序列为SEQIDNo.2。SEQIDNo.2的第7421-7816位所示的核苷酸序列为所述RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子ZmPolⅢca99，SEQIDNo.2的第7817-7919位所示的核苷酸序列为sgRNA的编码基因，SEQIDNo.2的第7920-8875位所示的核苷酸序列为CaMV35s启动子，SEQIDNo.2的第1-4116位所示的核苷酸序列为Cas9蛋白基因，SEQIDNo.2的第4139-4391位所示的核苷酸序列为NOS终止子，SEQIDNo.2的第5371-5959位所示的核苷酸序列为复制子ori，SEQIDNo.2的第6130-7095位所示的核苷酸序列为氨苄青霉素抗性基因。上述与生物材料中，B3)所述重组微生物具体可为细菌,酵母,藻和真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia),欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium),产碱菌属(Alcaligenes),假单胞菌属(Pseudomonas),芽胞杆菌属(Bacillus)等。B4)所述的转基因植物细胞系，B5)所述的转基因植物组织和B6)所述的转基因植物器官不包括植物的繁殖材料。上述重组载体pCas9-ZmPolⅢca99-sgRNA可通过使用PEG介导法、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了用于基因编辑的产品。本专利技术所提供的用于基因编辑的产品，含有B2)所述重组载体，B2)所述重组载体可含有sgRNA编码基因，上述RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子ZmPolⅢca99启动所述sgRNA编码基因的转录。本专利技术所提供的上述RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子ZmPolⅢca99在作为启动子中的应用也属于本专利技术保护的范围。本专利技术所提供的上述RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子ZmPolⅢca99在植物中启动sgRNA编码基因表达中的应用本文档来自技高网...

【技术保护点】
DNA分子，是下述a)或b)或c)的DNA片段：a)SEQ ID No.1所示的DNA分子；b)与a)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA分子；c)在严格条件下与a)或b)限定的DNA序列杂交，且具有启动子功能的DNA分子。

【技术特征摘要】
1.DNA分子，是下述a)或b)或c)的DNA片段：a)SEQIDNo.1所示的DNA分子；b)与a)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA分子；c)在严格条件下与a)或b)限定的DNA序列杂交，且具有启动子功能的DNA分子。2.含有权利要求1所述DNA分子的生物材料，为下述B1)至B6)中至少一种：B1)含有权利要求1所述DNA分子的表达盒；B2)含有权利要求1所述DNA分子的重组载体、或含有B1)所述表达盒的重组载体；B3)含有权利要求1所述DNA分子的重组微生物、或含有B1)所述表达盒的重组微生物、或含有B2)所述重组载体的重组微生物；B4)含有权利要求1所述DNA分子的转基因植物细胞系、或含有B1)所述表达盒的转基因植物细胞系；B5)含有权利要求1所述DNA分子的转基因植物组织、或含有B1)所述表达盒的转基因植物组织；B6)含有权利要求1所述DNA分子的转基因植物器官、或含有B1)所述表达盒的转基因植物器官。3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：B2)所述重组载体含有sgRNA编码基因，权利要求1所述DNA分子启动所述sgRNA编码基因的转录。4.用于基因编辑的产品，其特征在于：所述产品含有权利要求3所述的重组载体。5.权利要求1所述DNA分子在作为启动子中的应用...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢传晓，祁显涛，李新海，刘昌林，刘文国，路明，程备久，刘方，王慧，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11