一种空肠弯曲菌快速检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种用于快速检测空肠弯曲菌DNA存在的荧光定量PCR（聚合酶链式反应）检测试剂盒，适用于定性或定量检测空肠弯曲菌DNA的存在；空肠弯曲菌荧光定量PCR检测试剂盒包括：DNA提取液，PCR反应预混液，热启动Taq酶，阳性标准品，阴性质控品；与传统的细菌培养方法和生化鉴定相比，本发明专利技术提供了一种特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快且通量高的空肠弯曲菌荧光定量PCR检测试剂盒，具有更加省时、操作简便和定量准确等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种空肠弯曲菌快速检测试剂盒
本专利技术涉及一种用于快速检测空肠弯曲菌DNA存在的荧光定量PCR (聚合酶链式反应)检测试剂盒，适用于定性或定量检测空肠弯曲菌DNA的存在。
技术介绍
空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是引起胃肠道感染细菌性肠炎最常见的食源性病原体之一，是一种螺旋状、多形态性、微需氧的革兰阴性菌，为常见的人兽共患病原菌，多数家禽、家畜携带此菌，在其肠道内寄生，粪便或屠宰后的肠内容物散布于周围环境中，进而污染肉类或其他食品，造成食物中毒。可引起急性胃肠炎，也可导致心内腊炎、关节炎、败血症和血栓静脉等全身性疾病，还与人的急性感染性多发性神经根神经病，即格林巴利综合征的发生有密切关系。近年来，空肠弯曲菌感染的高发生率及其相关疾病的危害已经引起了广泛的关注。目前空肠弯曲菌检验仍以传统的培养法为主，但操作繁琐，耗时长，需4-5 d时间，才能最后确定是否为空肠弯曲菌，因此影响食物中毒的快速诊断和处理。随着分子生物学技术的发展，PCR技术广泛应用于细菌的快速诊断，然而传统PCR技术易污染，造成检测结果的假阳性。1996年美国应用生物系统公司(ABI)推出荧光定量PCR仪，实现了 PCR从定性到定量的飞跃。由于其具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点迅速成为了分子生物学研究中的重要工具。目前，该项技术已被应用于病原体测定、肿瘤基因检测、免疫分析、基因表达、突变及其多态性的研究等多个领域。因此，应用荧光定量PCR技术开发一种用于快速检测空肠弯曲菌的试剂盒是十分必要的。 【
技术实现思路
】 本专利技术的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快且通量高的空肠弯曲菌荧光定量PCR检测试剂盒，与传统的细菌培养方法和生化鉴定相比，具有更加省时、操作简便和定量准确等优点。 本专利技术主要包括试剂盒的组成和使用方法。 空肠弯曲菌荧光定量PCR检测试剂盒包括=(I)DNA提取液，(2) PCR反应预混液， (3)热启动Taq酶，(4)阳性标准品，(5)阴性质控品；具体的说: (I)DNA提取液 DNA 提取液包含:10mM Tris-HCl, ImM EDTA，ρΗ=8.0，体积分数为 10% 的 Chexe-100。 (2) PCR反应预混液 PCR反应预混液包括PCR反应缓冲成分(50mM KCl, 1mM Tris-HCl，pH 8.5)，各400 μ mol/L 的上游引物 hipO-1 和下游引物 hip0_2，200 μ mol/L 荧光探针 hip0_3，5mmol/L的MgCl2,4mmol/L的dNTPs (dATP，dGTP，dCTP和dTTP等体积混合物)和无菌双蒸水；hipO-Ι 序列为:5 ' - CCTCACTAGCAAAATCCACAGCTT- 3 ;， hipO-2 序列为:5 ' - TGCACAGGCTAATGATATAGRGATTA- 3 ' (R=A/G),hipO-3 序列为:5 ; - TATTCATAGTCACTGGTGCAAC- 3 ;，其中 5 ;标记 FAM 基团，3 ;标记MGB基团。 (3)热启动酶热启动Taq酶的浓度为5U/ul，每反应体系加入IU。 (4)阳性标准品阳性标准品是空肠弯曲菌特异性马尿酸酶(hippurate hydrolase ,hipO)基因中部分核酸片段连接到T载体上构建的质粒，该质粒在大肠杆菌中繁殖后，经纯化，可以用紫外分光光度法测定浓度后，稀释到16拷贝/y L，即为阳性标准品。 连接到T载体上的hipO基因核酸片段的序列为: CCTCACTAGCAAAATCCACAGCTTCATCGTTATTCATAGTCACTGGTGCAACAACATTTTTATTGATTTTAAT CCCTATATCATTAGCCTGTGCA。 (5)阴性质控品阴性质控品为无菌双蒸水。 本试剂盒的使用方法包括以下步骤:(1)样品处理及DNA提取；(2)配制PCR反应液；(3)在PCR反应液中分别加入样本DNA提取，阴性质控品和阳性标准品；(4)进行PCR扩增；(5)对荧光PCR结果进行分析。 本试剂盒和传统的培养法比较，具有以下优势:(I)检测速度快，检测时间从4-5天缩短至几个小时左右；(2 )特异性好，经测试与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、假单胞菌、志贺氏菌及李斯特氏菌等10几种常见的食源性致病菌无交差反应；(3)灵敏度高，最低检测限分别达到9个拷贝DNA/反应；(4)检测通量高，一次最多可以检测94个样本；(5)比培养法操作步骤简单。 与传统的细菌培养方法和生化鉴定相比，本专利技术提供了一种特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快且通量高的空肠弯曲菌荧光定量PCR检测试剂盒，具有更加省时、操作简便和定量准确等优点。 【具体实施方式】 下面结合具体具体实施实例，对本专利技术进一步说明，但专利技术的保护范围并不限于此。 实施例1:空肠弯曲菌荧光定量PCR检测试剂盒的试剂组成每个试剂盒为48个反应，主要成分包括: (I)DNA提取液DNA提取液成分为:10mM Tris-HCl, ImM EDTA，pH=8.0,体积分数为10%的Chexe-1OO ;共 5ml。 (2) PCR反应预混液 PCR反应预混液包括PCR反应缓冲成分(50mM KCl, 1mM Tris-HCl，pH 8.5)，各400 μ mol/L 的上游引物 hipO-Ι 和下游引物 hip0_2，200 μ mol/L 荧光探针 hip0_3，5mmol/L的MgCl2,4mmol/L的dNTPs (dATP, dGTP, dCTP和dTTP等体积混合物)和无菌双蒸水；共2管，每管llOOul。 (3)热启动酶热启动Taq酶的浓度为5U/ul ;共1ul。 (4)阳性标准品阳性标准品是空肠弯曲菌特异性马尿酸酶(hippurate hydrolase ,hipO)基因中部分核酸片段连接到T载体上构建的质粒，该质粒在大肠杆菌中繁殖后，经纯化，可以用紫外分光光度法测定浓度后，稀释到16拷贝/y L，即为阳性标准品。；共lOOul。 (5)阴性质控品阴性质控品为无菌双蒸水；共200ul。 实施例2:空肠弯曲菌荧光定量PCR检测试剂盒检测空肠弯曲菌具体方法为:(1)样品处理及DNA提取样品处理的方法参照GB/T 4789.9-2008《食品卫生微生物学检验空肠弯曲菌检验》进行。 取增菌液lmL，10 OOOrpm离心5分钟，弃上清保留沉淀，加入10uL DNA提取液，充分振荡混匀；100°c沸水浴或干浴10分钟；10 OOOrpm离心5分钟；取上清2.0uL作为PCR扩增的模板，其余保存在_20°C。(若提取的上清当天未进行PCR扩增，建议_20°C保存不超过I个月；再次使用时，应先10 OOOrpm离心5分钟。)(2)配制PCR反应液并加样取5ul的热启动Taq酶加入到IlOOul的PCR反应预混液，按每管18ul分装到PCR管，分别加入2ul的样本上清液，阴性质控品和阳性标准品。 (3) PCR 扩增PCR扩增的条件为:95°C预变性5min ;扩增4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测空肠弯曲菌DNA存在的快速荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：由DNA提取液、PCR反应预混液、热启动Taq 酶、阳性标准品和阴性质控品组成；所述的DNA是脱氧核糖核酸，所述的PCR是聚合酶链式反应，所述的Taq酶是一种耐热的DNA聚合酶。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测空肠弯曲菌DNA存在的快速荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于: 由DNA提取液、PCR反应预混液、热启动Taq酶、阳性标准品和阴性质控品组成；所述的DNA是脱氧核糖核酸,所述的PCR是聚合酶链式反应,所述的Taq酶是一种耐热的DNA聚合酶。2.根据权利要求1所述的荧光定量PCR试剂盒，其特征是:PCR反应预混液包括PCR反应缓冲成分(50mM KCl, 1mM Tris-HCl，pH 8.5)，各 400 μ mol/L 的上游引物 hipO-1 和下游引物 hip0-2，200ymol/L 荧光探针 hipO-3，5mmol/L 的 MgCl2,4mmol/L 的 dNTPs (dATP,dGTP，dCTP和dTTP等体积混合物)和无菌双蒸水； hipO-Ι 序列为:5 ' - CC...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘代新，潘海云，
申请(专利权)人：上海同科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31