FFPE样品核酸文库,其构建方法和FFPE样品分析方法技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，具体公开了一种FFPE样本核酸文库，其构建方法和分析FFPE样本的方法。具体的，本发明专利技术的核酸文库通过FFPE样本核酸的提取；核酸片段化；DNA片段末端修复及3’端连接“A”碱基；接头的连接及定量；片段选择；PCR扩增等步骤。本发明专利技术构建的FFPE文库能与目标序列捕获技术和测序技术相结合，为FFPE样本的分析提供了一种新的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因组学领域，特别是福尔马林固定石蜡包埋(formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE)样品核酸文库、其构建方法及一种FFPE样品的分析方法。
技术介绍
组织样品的保存多采用福尔马林固定石蜡包埋的方法，该方法在临床和科研领域的应用已有一个世纪。数量巨大的归档FFPE样品为回顾性研究，阐明疾病机制，发现治疗靶标和指示预后提供宝贵的资源。现阶段FFPE样品仅限于病理学观察，分子水平的研究正在兴起，可行性尚无定论。FFPE样品的研究极具挑战，首先，石蜡包埋的医疗样本十分珍贵，每个样本总量都很有限且不可替代；其次组织样品在离体后就开始发生降解，福尔马林的固定会使组织中的核酸发生不同程度的降解和分子间的交联，石蜡的高温渗入过程进一步加速核酸的降解，保存的时间及环境对样品中的核酸也有巨大的影响。因此如何从有限的且容易发生核酸降解的FFPE样本中成功提取可用于后续反应的核酸成为其用于分子水平回顾性研究的关键。第二代测序技术(nextgeneration sequencing，NGS)，例如 S0LEXA、S0LID、和 454 测序平台等[1]，大大本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种FFPE样本核酸文库的构建方法，包括以下的步骤 步骤一 FFPE样本核酸的提取；步骤二核酸片段化片段化的方法包括雾化、超声片段化、HydroShear或酶切处理，从而将核酸打断为大小为200-300bp的片段；步骤三DNA片段末端修复及3’端连接“A”碱基； 步骤四接头的连接将末端连接“A”碱基的DNA随机片段末端连接序列已知的接头； 步骤五片段选择将连接产物进行琼脂糖电泳，选择350-400bp进行切胶纯化； 步骤六PCR扩增根据已知的接头序列设计引物，进行PCR扩增，即得到FFPE样本核酸文库。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤一所述核酸的提取包括以下步骤 FFPE样本切片，切片浸于二甲苯或右旋柠檬烯中去除石蜡，振荡混勻后离心去除上清；用无水乙醇洗涤以去除二甲苯或右旋柠檬烯，离心去除上清；每IOmg组织加200-500ul加裂解缓冲液和l_3mg蛋白酶K，在消化期间添加2-4次蛋白酶K，50-60°C消化15-20小时； 消化后75-95°C孵育30-60分钟；对所得DNA进行纯化；所述裂解缓冲液成分10-50mmol/L Tris-HCl, pH 7. 4 ； 100-500mmol/LnaCl ； 5-20mmol/LEDTA, pH 8. 0 ；1-2%重量 SDS。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤一所述核酸的提取包括以下步骤 FFPE样本切片2-10微米，切片浸于二甲苯或右旋柠檬烯中去除石蜡，振荡混勻后离心去除上...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪雪玉，刘晓，王冠，张敏红，张秀清，杨焕明，
申请(专利权)人：深圳华大基因科技有限公司，深圳华大基因研究院，
类型：发明
国别省市：