葡聚糖酶，编码它们的核酸以及制备和使用它们的方法技术

本发明专利技术涉及具有葡聚糖酶，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶活性或这些活性的组合的多肽，和编码它们的多核苷酸。在一个方面，葡聚糖酶活性是内切葡聚糖酶活性(例如内-1,4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶活性)，和包括水解纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中的1,4-β-D-糖苷键，以及水解混合的β-1,3-葡聚糖，诸如谷物β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纤维素部分的其他植物中的β-1,4键。此外，本发明专利技术也提供了设计新酶的方法，和使用它们的方法。在可选择的方面，新型葡聚糖酶，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶或木聚糖酶在增高的pH和温度中具有增加的活性和稳定性。

【技术实现步骤摘要】
葡聚糖酶，编码它们的核酸以及制备和使用它们的方法本申请是分案申请，原申请的申请日为2004年07月02日、申请号为200480025009.2(PCT/US2004/021492)、专利技术名称为“葡聚糖酶，编码它们的核酸以及制备和使用它们的方法”。查阅提交在光盘上的序列表本申请包括光盘(一式四份提交)，该光盘中含有序列表。序列表的全部内容通过参考并入本文。序列表在光盘上标识如下：专利
总体上说，本专利技术涉及酶，编码该酶的多核苷酸，该多核苷酸和多肽的用途；更具体地，本专利技术涉及具有葡聚糖酶，例如内切葡聚糖酶活性的多肽（例如酶、抗体），内切葡聚糖酶活性例如催化内部的内-β-1,4-和/或β-1,3-葡聚糖酶键（glucanaselinkages）的水解。在一个方面，内切葡聚糖酶活性(例如内-1,4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶活性)包括水解在纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中的1,4-和/或β-1,3-β-D-糖苷键，水解混合的β-1,3-葡聚糖，诸如谷物β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纤维素部分的其他植物或有机物质中的β-1,4键。在一个方面，本专利技术多肽具有木聚糖酶或甘露聚糖酶活性。专利技术背景内切葡聚糖酶(例如内-β-1,4-葡聚糖酶，EC3.2.1.4；内-β-1,3(1)-葡聚糖酶，EC3.2.1.6；内-β-1,3-葡聚糖酶,EC3.2.1.39)水解纤维素和葡聚糖的内部β-1,4-和/或β-1,3-糖苷键，产生分子量较小的葡萄糖和葡萄糖寡聚体。葡聚糖是多糖，由1,4-β-和/或1,3-糖苷-连接的D-吡喃型葡萄糖形成。内切葡聚糖酶具有相当大的商业价值，被用于食品工业、用于焙烤和果蔬加工、农业废物降解、用于生产动物饲料(例如鸡饲料)、用于浆和纸的生产、纺织品制造和家用和工业洗涤剂。内切葡聚糖酶由真菌和细菌产生。β-葡聚糖是谷物中主要的非-淀粉多糖。取决于种类和生长条件，葡聚糖含量可以变化很大。这种多糖的物化特性导致能在氧化条件下产生粘性溶液或者甚至产生凝胶。此外，葡聚糖的水结合能力（water-bindingcapacity）高。所有这些特性为若干工业包括酿造、焙烤、动物营养带来了问题。在酿造应用中，葡聚糖的存在产生麦芽汁过滤难和浑浊形成问题（hazeformationissues）。在焙烤应用（特别是糕点和饼干）中，葡聚糖会产生发粘面团，这使得难以加工（machine），并减小饼干的大小。此外，该碳水化合物与焙烤的产品的快速再水化密切相关，导致脆性丧失，货架期减短。对于用谷物食物制成的单胃动物（monogastricanimal）饲料的应用，β-葡聚糖是肠内物质粘性的成因，因此不利地影响饲料的可消化性和动物的生长速度。对于反刍动物，这些β-葡聚糖是摄入的纤维的基本组分，葡聚糖较完全的消化将有助于获得较高的食物转化效率。内切葡聚糖酶在动物胃中具有活性对动物饲料是有利的。内切葡聚糖酶对于消化所有植物物质中发现的纤维素、β-1,4-连接的葡聚糖也是重要的。纤维素是自然界中最丰富的多糖。消化纤维素的酶在浆和纸工业、在纺织品制造和家用和工业用洗涤剂中具有利用价值。在此讨论的出版物被提供，仅仅是显示了它们先于本专利技术申请日而公开。并不能凭借在此的任何内容认为，本专利技术没有资格先于在前专利技术的那些公开内容。专利技术概述本专利技术提供了分离的、合成的、或重组的核酸，该核酸包括与本专利技术的示范性核酸具有至少约50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或更大的序列同一性或完全的(100%)序列同一性的序列，所述本专利技术的示范性核酸例如SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:43、SEQIDNO:45、SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO:51、SEQIDNO:53、SEQIDNO:55、SEQIDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67、SEQIDNO:69、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75、SEQIDNO:77、SEQIDNO:79、SEQIDNO:81、SEQIDNO:83、SEQIDNO:85、SEQIDNO:87、SEQIDNO:89、SEQIDNO:91、SEQIDNO:93、SEQIDNO:95、SEQIDNO:97、SEQIDNO:99、SEQIDNO:101、SEQIDNO:103、SEQIDNO:105、SEQIDNO:107、SEQIDNO:109、SEQIDNO:111、SEQIDNO:113、SEQIDNO:115、SEQIDNO:117、SEQIDNO:119、SEQIDNO:121、SEQIDNO:123、SEQIDNO:125、SEQIDNO:127、SEQIDNO:129、SEQIDNO:131、SEQIDNO:133、SEQIDNO:135、SEQIDNO:137、SEQIDNO:139、SEQIDNO:141、SEQIDNO:143、SEQIDNO:145、SEQIDNO:147、SEQIDNO:149、SEQIDNO:151、SEQIDNO:153、SEQIDNO:155、SEQIDNO:157、SEQIDNO:199、SEQIDNO:161、SEQIDNO:163、SEQIDNO:165、SEQIDNO:167、SEQIDNO:169、SEQIDNO:171、SEQIDNO:173、SEQIDNO:175、SEQIDNO:177、SEQIDNO:179、SEQIDNO:181、SEQIDNO:183、SEQIDNO:185、SEQIDNO:187、SEQIDNO:189、SEQIDNO:191、SEQIDNO:193、SEQIDNO:195、SEQIDNO:197、SEQIDNO:199、SEQIDNO:201、SEQIDNO:203、SEQIDNO:205、SEQIDNO:207、SEQIDNO:209、SEQIDNO:211、SEQIDNO:213、SEQIDNO:215、SEQIDNO:217、SEQIDNO:219、SEQIDNO:221、SEQIDNO:223、SEQIDNO:225、SEQIDNO:227、SEQIDNO:229、SEQI本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离或重组的核酸，所述核酸包括与SEQ?ID?NO:175具有至少50%的序列同一性的核酸序列，所述序列同一性在至少约20、30、40、50、60、75或100个残基的区域内，其中所述核酸编码至少一种具有葡聚糖酶活性的多肽，所述序列同一性通过采用序列比对算法的分析或通过目视检查法来测定。

【技术特征摘要】
2003.07.02 US 60/484,7251.分离或重组的核酸，所述核酸由SEQIDNO:175中示出的核酸序列组成，其中所述核酸编码具有葡聚糖酶活性的多肽。2.如权利要求1所述的分离或重组的核酸，其中所述核酸序列编码由SEQIDNO:176中示出的序列组成的多肽。3.如权利要求1所述的分离或重组的核酸，其中所述葡聚糖酶活性包括内切葡聚糖酶活性。4.如权利要求1所述的分离或重组的核酸，其中所述葡聚糖酶活性包括催化水解1,4-β-D-糖苷键或内部β-1,3-糖苷键，或水解葡聚糖，产生较小分子量的多糖或寡聚体。5.如权利要求3所述的分离或重组的核酸，其中所述内切葡聚糖酶活性包括内-1,4-β-内切葡聚糖酶活性。6.如权利要求5所述的分离或重组的核酸，其中所述1,4-β-D-糖苷键活性包括水解纤维素或纤维素衍生物、地衣多糖或谷物中的1,4-β-D-糖苷键。7.如权利要求6所述的分离或重组的核酸，其中所述纤维素衍生物包括羧甲基纤维素或羟乙基纤维素。8.如权利要求6所述的分离或重组的核酸，其中所述谷物包括β-D-葡聚糖或木葡聚糖。9.如权利要求1所述的分离或重组的核酸，其中所述葡聚糖酶活性包括水解包括1,4-β-糖苷-连接的D-吡喃型葡萄糖的多糖。10.如权利要求1所述的分离或重组的核酸，其中所述葡聚糖酶活性包括水解纤维素、纤维素衍生物或半纤维素。11.如权利要求10所述的分离或重组的核酸，其中所述葡聚糖酶活性包括水解木浆或纸浆或木产品或纸产品中的纤维素或半纤维素。12.如权利要求1所述的分离或重组的核酸，其中所述葡聚糖酶活性包括催化水解饲料、食物产品或饮料中的葡聚糖。13.如权利要求12所述的分离或重组的核酸，其中所述饲料、食物产品或饮料包括以谷物为基础的动物饲料、麦芽汁或啤酒、面团、水果或蔬菜。14.如权利要求1所述的分离或重组的核酸，其中所述葡聚糖酶活性包括催化水解微生物细胞、真菌细胞、哺乳动物细胞、或植物细胞中的葡聚糖。15.如权利要求1所述的分离或重组的核酸，其中所述葡聚糖酶活性具有热稳定性。16.如权利要求15所述的分离或重组的核酸，其中所述多肽在一定的温度条件下仍保留葡聚糖酶活性，所述条件包括在37℃至95℃之间的温度、或55℃至85℃之间的温度、70℃至75℃之间的温度、或70℃至95℃之间的温度、或90℃至95℃之间的温度。17.如权利要求1所述的分离或重组的核酸，其中所述葡聚糖酶活性具有耐热性。18.如权利要求17所述的分离或重组的核酸，其中所述多肽在暴露于37℃至95℃、55℃至85℃、或70℃至75℃之间、或90℃至95℃范围内的温度后，仍保留葡聚糖酶活性。19.表达盒，包括核酸，所述核酸由权利要求1中所述的序列组成。20.载体，包括核酸，所述核酸由权利要求1中所述的序列组成。21.克隆载体，包括核酸，所述核酸由权利要求1中所述的序列组成，其中所述克隆载体包括病毒载体、质粒、或人工染色体。22.如权利要求21所述的克隆载体，其中所述病毒载体包括腺病毒载体、逆转录病毒载体、或腺-相关病毒载体。23.如权利要求21所述的克隆载体，其中所述病毒载体还包括噬菌体。24.如权利要求23所述的克隆载体，其中所述噬菌体包括细菌噬菌体。25.如权利要求21所述的克隆载体，其中所述质粒包括粘端质粒和噬菌粒。26.如权利要求25所述的克隆载体，其中所述粘端质粒包括F粘粒。27.如权利要求21所述的克隆载体，包括细菌人工染色体(BAC)、细菌噬菌体P1-衍生的载体(PAC)、酵母人工染色体(YAC)、或哺乳动物人工染色体(MAC)。28.转化细胞，其包含由在权利要求1中所示的序列组成的核酸。29.转化细胞，其包括权利要求19所述的表达盒。30.如权利要求29所述的转化细胞，其中所述细胞是细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、昆虫细胞。31.如权利要求30所述的转化细胞，其中所述真菌细胞包括酵母细胞。32.权利要求1中所述的序列在制备转基因植物中的应用。33.如权利要求32所述的应用，其中所述植物是高梁植物、马铃薯植物、西红柿植物、小麦植物、含油种子植物、大米植物、大麦植物、草、或烟草植物。34.如权利要求33所述的应用，其中所述含油种子植物包括玉米植物。35.如权利要求1中所述的序列在制备转基因种子中的应用。36.如权利要求35所述的应用，其中所述种子是小麦仁、含油种子、大米、大麦、或烟草植物种子。37.如权利要求36所述的应用，其中所述含油种子是玉米种子、棕榈仁、向日葵种子、芝麻种子、和花生。38.分离或重组的多肽，其(i)由SEQIDNO:176中示出的序列组成；或(ii)由SEQIDNO:175中示出的序列组成的核酸所编码。39.如权利要求38所述的分离或重组的多肽，其中所述多肽具有葡聚糖酶活性。40.如权利要求39所述的分离或重组的多肽，其中所述葡聚糖酶活性包括内切葡聚糖酶活性。41.如权利要求40所述的分离或重组的多肽，其中所述内切葡聚糖酶活性包括内-1,4-β-内切葡聚糖酶活性，或包括催化水解1,4-β-D-糖苷键或内部β-1,3-糖苷键。42.如权利要求41所述的分离或重组的多肽，其中所述1,4-β-D-糖苷键活性包括水解纤维素或纤维素衍生物、地衣多糖或谷物中的1,4-β-D-糖苷键。43.如权利要求42所述的分离或重组的多肽，其中所述纤维素衍生物包括羧甲基纤维素或羟乙基纤维素。44.如权利要求42所述的分离或重组的多肽，其中所述谷物包括β-D-葡聚糖或木葡聚糖。45.如权利要求39所述的分离或重组的多肽，其中所述葡聚糖酶活性包括水解包括1,4-β-糖苷-连接的D-吡喃型葡萄糖的多糖。46.如权利要求39所述的分离或重组的多肽，其中所述葡聚糖酶活性包括水解纤维素、纤维素衍生物或半纤维素。47.如权利要求46所述的分离或重组的多肽，其中所述葡聚糖酶活性包括水解木浆或纸浆或纸产品中的纤维素或半纤维素。48.如权利要求39所述的分离或重组的多肽，其中所述葡聚糖酶活性包括催化水解饲料、食物产品或饮料中的葡聚糖。49.如权利要求48所述的分离或重组的多肽，其中所述饲料、食物产品或饮料包括以谷物为基础的动物饲料、面团、麦芽汁或啤酒、水果或蔬菜。50.如权利要求39所述的分离或重组的多肽，其中所述葡聚糖酶活性包括催化水解微生物细胞或植物细胞中的木聚糖。51.如权利要求39所述的分离或重组的多肽，其中所述葡聚糖酶活性催化水解可发酵糖，产生燃料产品。52.如权利要求39所述的分离或重组的多肽，其中所述葡聚糖酶活性具有热稳定性。53.如权利要求52所述的分离或重组的多肽，其中所述的多肽在一定条件下仍保留有葡聚糖酶活性，所述条件包括1℃至5℃之间、5℃至15℃之间、15℃至25℃之间、25℃至37℃之间、37℃至95℃之间、55℃至85℃之间、70℃至95℃之间、70℃至75℃之间、或90℃至95℃之间的温度。54.如权利要求39所述的分离或重组的多肽，其中所述葡聚糖酶活性具有耐热性。55.如权利要求54所述的分离或重组的多肽，其中，在暴露于1℃至5℃之间、5℃至15℃之间、15℃至25℃之间、25℃至37℃之间、37℃至95℃之间、55℃至85℃之间、70℃至75℃之间、或90℃至95℃之间的温度或更高的温度之后，所述多肽保留葡聚糖酶活性。56.分离或重组的多肽，包括权利要求38所述的多肽，并缺少信号序列或前体序列。57.分离或重组的多肽，包括权利要求38所述的多肽，并具有异源信号序列或异源前体序列。58.如权利要求39所述的分离或重组的多肽，其中所述葡聚糖酶活性在37℃时其比活为每毫克蛋白100至1000单位、每毫克蛋白500至750单位、每毫克蛋白500至1200单位、或每毫克蛋白750至1000单位。59.如权利要求54所述的分离或重组的多肽，其中所述的耐热性包括在被加热至升高的温度后保留其在37℃时的葡聚糖酶比活的至少一半。60.如权利要求54所述的分离或重组的多肽，其中所述的耐热性包括在被加热至升高的温度后，保留有在37℃时的比活，其范围是从每毫克蛋白500至1200单位。61.如权利要求38所述的分离或重组的多肽，所述多肽包括至少一个糖基化位点。62.如权利要求61所述的分离或重组的多肽，其中所述糖基化是N-联糖基化。63.如权利要求62所述的分离或重组的多肽，其中所述多肽在巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)或粟酒裂殖酵母(S.pombe)中表达之后被糖基化。64.如权利要求39所述的分离或重组的多肽，所述多肽在包括pH6.5、pH6.0、pH5.5、pH5.0、pH4.5或pH4.0的条件下，保留葡聚糖酶活性。65.如权利要求39所述的分离或重组的多肽，其中所述多肽在包括pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9、pH9.5、pH10或pH10.5的条件下，保留葡聚糖酶活性。66.蛋白质制品，其包括权利要求38所述的多肽，其中所述蛋白质...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·斯蒂尔，W·卡伦，S·希利，D·普利安，
申请(专利权)人：维莱尼姆公司，
类型：发明
国别省市：