本发明专利技术公开一种香菇C91-3菌株的Latcripin-5基因片段、编码蛋白及制备方法，Latcripin-5基因片段，具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列；编码蛋白具有如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。Latcripin-5基因片段的制备方法按如下步骤进行：提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA；将菌丝体总RNA反转录合成cDNA；PCR扩增目标基因：以所得到的cDNA为模板、以具有EcoRⅠ和XhoⅠ两个酶切位点的PCR反应引物进行PCR反应；回收纯化DNA片段。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开一种，Latcripin-5基因片段，具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列；编码蛋白具有如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。Latcripin-5基因片段的制备方法按如下步骤进行：提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA；将菌丝体总RNA反转录合成cDNA；PCR扩增目标基因：以所得到的cDNA为模板、以具有EcoRⅠ和XhoⅠ两个酶切位点的PCR反应引物进行PCR反应；回收纯化DNA片段。【专利说明】香薛C91-3菌株的Later ipi n-5基因片段、编码蛋白及制备方法
本专利技术涉及一种从香菇C91-3菌株中提取的Laicripiz7-S基因片段、编码蛋白及制备方法，所编码的蛋白具有DNA/RNA非限制性核酸内切酶结构域，具有非限制性核酸内切酶活性、诱导肿瘤细胞凋亡、调节机体免疫力、调节细胞周期及抗肿瘤等功能。
技术介绍
真菌富含多种生物活性分子，包括核糖体失活蛋白、抗真菌蛋白、凝集素、泛素样蛋白、多糖和激酶。其中的抗肿瘤成分以不良反应少、疗效显著等优点在肿瘤治疗方面具有独到之处。香菇菌C91-3属真菌为担子菌亚门担子菌纲侧耳科，该菌种已于2013年保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.7354。香菇菌C91-3含有健脾益气，扶正祛邪，增强机体免疫力，防治癌症等功效。.Bioehem J,2003,374:321— 327]。香菇菌C91-3发酵液中含有多种蛋白成分，通过动物体内实验证实有些蛋白成分具有较好的抗肿瘤作用.中国微生态学杂志，1996，8 (3):38-50]。体外实验也证实，其发酵液中的一些蛋白组分具有诱导肿瘤细胞凋亡的能力。但是，迄今为止还没有关于从香菇C91-3菌中提取具有诱导肿瘤细胞凋亡的基因片段、编码蛋白及制备方法等相关报道。
技术实现思路
本专利技术是为了解决现有技`术所存在的上述技术问题，提供一种从香菇C91-3菌株中提取的基因片段、编码蛋白及制备方法，所编码的蛋白具有DNA/RNA非限制性核酸内切酶结构域，具有诱导肿瘤细胞凋亡、调节机体免疫力、调节细胞周期及抗肿瘤等功能。本专利技术的技术解决方案是一种香菇C91-3菌株的Laicripiz7-S基因片段，其特征在于如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。一种上述香菇C91-3菌株的基因片段编码蛋白，其特征在于如SEQID NO: 2所示的氨基酸序列。一种上述香菇C91-3菌株的基因片段的制备方法，其特征在于依次按如下步骤进行: a.提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA； b.将菌丝体总RNA反转录合成cDNA； c.PCR扩增目标基因: 以所得到的cDNA为模板、以具有EcoR I和Xho I两个酶切位点的PCR反应引物进行PCR反应；所述PCR反应引物序列如下: 上游引物EcoR I:5’- ATCGGATCCGAATTCGTAAGGCAAGCCTACGTTG _3’ 下游引物Xho I:5’- GGTGGTGGTGCTCGAGAGACTTGACTGCGTCCGAG -3’ d.回收纯化DNA片段: 将所得到的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，纯化681bpMarker附近的明显条带，切胶回收DNA片段。所述a步骤是取培养18天的香菇C91-3菌株的菌丝体，于研钵中加入液氮充分研磨，加入Trizol后室温静置30min,样品融化后继续研磨至裂解液透明状,室温静置5min后，12000r/min离心5min,将上清转移至新的离心管中，然后加入1/5体积氯仿,温和振荡后，4°C，12000r/min离心，15min ;吸取上层水相溶液并转移至另一离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温静止15min，再次4°C，12000r/min离心，IOmin,弃上清，然后加入75%乙醇洗涤并干燥，最后用DEPC处理水溶解，得到香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA。所述c步骤的PCR反应体系50 μ?: cDNA模板?μ?，上游引物0.5μ1，下游引物0.δμΙ,?ΝΤΡ Mixture(各2.5 mM)4 μ?,5XPrimeSTAR BuffeKMg2+ plus) 10 μ?,PrimeSTARHS DNA PolymeraseC2.5 υ/μ1)0.5 μ?、灭菌蒸馏水 33.5μ1 ;反应条件:98°C变性 10s，55。。复性 10s，72。。延伸 lmin, 30 个循环；72°C延伸 5min ;4°C冷却 IOmin0本专利技术是从香菇C91-3菌丝体转录组中，克隆出一段特异性基因片段，命名为LatcripinS基因片段，该基因片段所编码的蛋白具有DNA/RNA非限制性核酸内切酶结构域，具有诱导肿瘤细胞凋亡、调节机体免疫力、调节细胞周期及抗肿瘤等功能。可将该基因片段进行基因重组，并于pET32-a原核表达体系中进行高效的表达，将表达产物通过亲和层析进行分离和提纯，获得该基因编码的蛋白质，该蛋白可用于研究细胞凋亡中的机制及其在细胞信号通路中的作用，也可用于制备预防或治疗肿瘤的药物。【专利附图】【附图说明】图1是本专利技术实施例PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳图。图2是本专利技术实施例所用载体pET32a (+)双酶切后的电泳图。图3是本专利技术实施例提取的基因片段转化后的单克隆阳性菌落。图4是本专利技术实施例重组表达蛋白的SDS-PAGE电泳图。图5是本专利技术实施例诱导表达蛋白的Western-blot电泳图。图6是本专利技术实施例纯化后的目标蛋白SDS-PAGE电泳图。图7是本专利技术实施例纯化后的目标蛋白对A549细胞的生长抑制率不意图。图8是本专利技术实施例纯化后的目标蛋白非限制性内切酶活性检测电泳图。香菇C91-3菌株保藏日期:2013年3月15日； 分类命名?.香菇 iLentinula edodes)； 保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)； 保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号 保藏号:CGMCC N0.7354。【具体实施方式】a.提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA: 取用培养基培养18天的香菇C91-3菌株的菌丝体，于研钵中加入液氮充分研磨,加入Iml的Trizol室温放置5min,然后加入0.2ml氯仿,温和振荡后,4°C, 12000r/min离心，15min ;吸取上层水相溶液0.5ml并转移至另一干净的1.5ml离心管,加入等体积异丙醇，颠倒混匀后室温静止15min,再次4°C, 12000r/min离心，lOmin,弃上清,然后加入75%乙醇Iml洗涤并干燥，最后用DEPC处理水溶解，香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA ； 紫外分光光度计验证纯度，0D260/280比值在1.8^2.0之间。进行1.0%琼脂糖凝胶电泳验证，表明RNA提取纯度较高。b.将菌丝体总RNA反转录合成⑶NA ; 使用TaKaRa 3' -Full RACE Core Set Ver.2.0试剂盒反转录合成cDNA，本试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。反应体系:香菇菌丝体总RNA (I ug/μ?) I μ1、3’ RACE Adaptor (5 uM) I μ?、dNTP Mixture (1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种香菇C91?3菌株的Latcripin?5基因片段，其特征在于如SEQ?ID?NO：1?所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄敏，刘奔，曹淑云，钟民涛，伦永志，张伟，李星云，王晓丽，曹婧，宁安红，
申请(专利权)人：大连医科大学，
类型：发明
国别省市：
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