生产L‑亮氨酸菌株和生产L‑亮氨酸的方法技术

本发明专利技术涉及生物工程技术领域，尤其涉及生产L‑亮氨酸菌株和生产L‑亮氨酸的方法。本发明专利技术以紫外线和亚硝基胍对谷氨酸棒杆菌进行诱变，获得了两个有利于L‑亮氨酸产生的关键突变leuA

【技术实现步骤摘要】
生产L-亮氨酸菌株和生产L-亮氨酸的方法
本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及生产L-亮氨酸菌株和生产L-亮氨酸的方法。
技术介绍
L-亮氨酸即α-氨基-γ-甲基戊酸或α-氨基异己酸，属于支链氨基酸，是人体必须依赖外源供给的八大必需氨基酸之一。L-亮氨酸是亮氨酸的左旋体，在医药、食品、化妆品、及饲料等行业中具有非常广泛的应用。在L-亮氨酸的生产中常用提取法、化学合成法、酶催化法和微生物发酵法。其中，微生物发酵法以其环保、条件温和、质量稳定等优点成为L-亮氨酸生产的主要方法。在L-亮氨酸生产行业中日本企业占主导地位，尤其是日本味之素公司，其在亮氨酸生产中具有非常明显的优势。目前，随着生物学的不断发展进步，L-亮氨酸在棒杆菌属中的生物合成途径及其调控机制已掌握清楚。谷氨酸棒杆菌模式菌株ATCC13869基因组测序的完成及谷氨酸棒杆菌基因操作技术的不断完善，使得通过基因工程手段对谷氨酸棒杆菌进行改造成为现实。研究表明，在L-亮氨酸的合成途径中，存在多个关键酶，其中，leuA编码α-异丙基苹果酸合酶，催化α-酮异戊酸合成α-异丙基苹果酸，是L-亮氨酸合成途径的关键酶，受终产物L-亮氨酸的反馈抑制。ilvBN编码乙酰羟酸合酶，受L-亮氨酸、L-缬氨酸及L-异亮氨酸的反馈抑制，其中ilvB编码乙酰羟酸合酶的大亚基，起催化作用。解除反馈抑制有助于提高L-亮氨酸等支链氨基酸的产量。现有的亮氨酸生物合成菌株和方法已经逐渐不能满足日益加大的市场需求，因此，利用生物工程方法，进一步开发能够大量生成亮氨酸的菌株和生产方法成为了研究的热点。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供生产L-亮氨酸菌株和生产L-亮氨酸的方法，本专利技术提供的菌株产亮氨酸的量可达4.7g/L。本专利技术提供了突变的leuA蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术提供了编码突变的leuA蛋白的DNA分子。编码突变的leuA蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术还提供了突变的ilvB蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。本专利技术提供了编码突变的ilvB蛋白的DNA分子。编码突变的ilvB蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。所述突变是指遗传物质发生改变，其可为点突变或片段突变。具体为氨基酸或碱基的添加、缺失或替换。其为紫外诱变后以亚硝基胍诱变获得。紫外诱变的条件为紫外15W，30cm，20分钟；亚硝基胍诱变的条件为0.5mg/mL，33℃，30分钟；诱变后，筛选对4-氮杂亮氨酸最具有抗性的突变菌株。培养基中，4-氮杂亮氨酸的浓度为1g/L。含有1g/L的4-氮杂亮氨酸琼脂板基本培养基中还包括：葡萄糖20g/L、(NH4)2SO42.0g/L、MgSO4·7H2O0.4g/L、CaCl2·2H2O0.01g/L、FeSO4·7H2O0.02g/L、Na2HPO4·12H2O1.5g/L、生物素0.02mg/L、维生素B10.02mg/L、ZnSO40.01g/L、MnSO40.01g/L、KH2PO41.5g/L、琼脂18g/L。pH值为7.0～7.3。leuA编码α-异丙基苹果酸合酶，催化α-酮异戊酸合成α-异丙基苹果酸，是L-亮氨酸合成途径的关键酶。本专利技术中leuA蛋白的突变是指在野生型leuA蛋白的氨基酸序列中发生突变，具体的：突变的leuA蛋白为，天冬氨酸取代野生型leuA蛋白的序列中561位的甘氨酸。实验表明，leuA蛋白中发生G561D突变后，L-亮氨酸合成途径中的反馈机制得到解除，L-亮氨酸的产量得到提高。ilvBN编码乙酰羟酸合酶，受L-亮氨酸、L-缬氨酸及L-异亮氨酸的反馈抑制，其中ilvB编码乙酰羟酸合酶的大亚基，起催化作用。本专利技术中ilvB蛋白的突变是指在野生型ilvB蛋白的氨基酸序列中发生突变，具体的：突变的ilvB蛋白为，丝氨酸取代野生型ilvB蛋白的序列中235位的甘氨酸。实验表明，ilvB蛋白中发生G235S突变后，L-亮氨酸合成途径中的反馈机制得到解除，L-亮氨酸的产量得到提高。本专利技术提供了一种重组菌株，其表达编码突变的leuA蛋白的DNA分子。这一重组菌株的起始菌株为谷氨酸棒杆菌。表达编码突变的leuA蛋白的DNA分子的重组菌株在生产L-亮氨酸中的应用。该菌株的构建方法为：以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，拼接PCR获得起始表达编码突变的leuA蛋白的DNA分子，构建入质粒载体后，电穿孔法转化入谷氨酸棒杆菌，获得重组菌株。所述谷氨酸棒杆菌为ATCC13869；其感受态细胞的获得方式参照谷棒经典方法。获得起始表达编码突变的leuA蛋白的DNA分子的方法为：采用SEQIDNO:5～6所示引物对和SEQIDNO:7～8所示引物对分别对谷氨酸棒杆菌ATCC13869的基因组DNA进行扩增，获得上游片段(leuA-up)和下游片段(leuA-dn)；以leuA-up、leuA-dn两片段混合物为模板，以SEQIDNO:5所示引物和SEQIDNO:8所示引物进行扩增，获得起始表达编码突变的leuA蛋白的DNA分子(SEQIDNO:2)。所述质粒载体为pK18mobsacB。所述构建入质粒载体的酶切位点为XbaI、SalI。构得载体记为pK18mobsacB-leuAG561D。表达编码突变的leuA蛋白的DNA分子的重组菌株获得后，参照谷棒经典方法制备其感受态细胞。本专利技术提供了一种重组菌株，其表达编码突变的ilvB蛋白的DNA分子。其起始菌株为谷氨酸棒杆菌。本专利技术提供的重组菌株在生产L-亮氨酸中的应用。该菌株的构建方法为：以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，拼接PCR获得起始表达编码突变的ilvB蛋白的DNA分子，构建入质粒载体后，电穿孔法转化入谷氨酸棒杆菌，获得重组菌株。所述谷氨酸棒杆菌为ATCC13869；其感受态细胞的获得方式参照谷棒经典方法。获得起始表达编码突变的ilvB蛋白的DNA分子的方法为：采用SEQIDNO:9～10所示引物对和SEQIDNO:11～12所示引物对分别对谷氨酸棒杆菌ATCC13869的基因组DNA进行扩增，获得上游片段(ilvB-up)和下游片段(ilvB-dn)；以ilvB-up、ilvB-dn两片段混合物为模板，以SEQIDNO:9所示引物和SEQIDNO:12所示引物进行扩增，获得起始表达编码突变的ilvB蛋白的DNA分子(SEQIDNO:4)。所述质粒载体为pK18mobsacB。所述构建入质粒载体的酶切位点为XbaI、SalI。构得载体记为pK18mobsacB-ilvBG235S。表达编码突变的ilvB蛋白的DNA分子的重组菌株获得后，参照谷棒经典方法制备其感受态细胞。本专利技术提供了一种重组菌株，其表达编码突变的leuA蛋白的DNA分子，且表达编码突变的ilvB蛋白的DNA分子。其起始菌株为谷氨酸棒杆菌。本专利技术提供的重组菌株在生产L-亮氨酸中的应用。该菌株的构建方法为：以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，拼接PCR获得起始表达编码突变的leuA蛋白的DNA分子，构建入质粒载体，电穿孔法转化入谷氨酸棒杆菌，获得leuAG561D重组菌株；所述谷氨酸棒杆菌为ATCC13869；感受态细胞的获得方式参照谷棒经典方法。以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，拼接PCR获得起始表达编码突变的本文档来自技高网...

【技术保护点】
突变的leuA蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.突变的leuA蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。2.编码权利要求1所述突变的leuA蛋白的DNA分子。3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。4.突变的ilvB蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。5.编码权利要求4所述突变的ilvB蛋白的DNA分子。6.根据权利要求4所述的DNA分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。7.一种重组菌株，其特征在于，表达权利要求2或3所述的DNA分子。8.一种重组菌株，其特征在于，表达权利要求5或6所述的DNA分子...

【专利技术属性】
技术研发人员：常静，胡丹，程江红，刁刘洋，毛贤军，
申请(专利权)人：廊坊梅花生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：河北,13