一种改进的转氨酶及其在(R)‑3‑氨基丁醇制备上的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种改进的转氨酶、编码基因及其在(R)‑3‑氨基丁醇制备上的应用。该改进的转氨酶的酶活性高于野生型转氨酶的酶活性，野生型转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，来源于土曲霉菌Aspergillus terreus NIH2624，改进的转氨酶包含与SEQ ID No.2所示氨基酸序列有至少95％序列同源性的氨基酸序列，且对应于SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第215位为脯氨酸残基。其中改进的转氨酶用于制备(R)‑3‑氨基丁醇的反应条件温和，产物手性纯度及收率均较高，底物浓度高达50g/L，具有较好的工业应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种改进的转氨酶及其在(R)-3-氨基丁醇制备上的应用
本专利技术属于生物制药领域，具体涉及一种改进的转氨酶、编码基因及其在(R)-3-氨基丁醇制备上的应用。
技术介绍
(R)-3-氨基丁醇在化学反应和药物合成方面有着广泛的应用，可作为多种手性药物的关键中间体。比如抗HIV药物度鲁特韦(Dolutegravir)，该药由葛兰素史克(GSK)研发生产，2013年8月12日获美国食品和药物管理局(FDA)批准上市。度鲁特韦自上市以来销售额呈现飞跃式发展，2015年度全球销售额高达90亿美元。(R)-3-氨基丁醇常温常压下是一种无色黏稠液体，分子量为89.14，可溶于水、乙醇、乙酸乙酯等溶剂中，其结构式如下所示：目前公布的(R)-3-氨基丁醇的合成方法以化学法为主，一种是采用动力学拆分法获得手性纯的3-氨基丁醇(JournalofOrganicChemistry,42,1650,1977)，该方法产品收率低，反应过程采用四氢铝锂作为还原剂，工业化放大生产较危险。另一种是以手性化合物作为起始原料，如D-丙氨酸或R型苯乙胺通过多步反应获得手性纯的3-氨基丁醇(Tetrahedron,61,9031,2005和CN101417954B)，这一类方法中手性纯原料价格较贵，且反应步骤冗长，生产成本较高。与化学合成法相比，生物合成法具有反应条件温和、转化率高和立体选择性强等优点，目前利用生物法制备(R)-3-氨基丁醇的报道还较少。转氨酶能够不对称催化潜手性酮类化合物一步合成手性胺类化合物，具有较好的应用前景。专利CN104131048A公开了一种利用野生型D-转氨酶不对称催化4-羟基-2丁酮合成(R)-3-氨基丁醇的方法，但其反应底物浓度最高仅为300mM(26.4g/L)，无法满足工业化生产需求，仅停留在实验室研究阶段，同时反应过程中需使用10％的有机助溶剂DMSO或乙腈，这也增加了反应后处理的操作和成本，工业三废排放量加大。
技术实现思路
为了克服现有技术所存在的上述缺陷，本专利技术提供了一种改进的转氨酶，同时还公开了该转氨酶的编码基因、重组表达基因工程菌及其在(R)-3-氨基丁醇制备上的应用。本专利技术第一方面提供了一种改进的转氨酶，其酶活性高于野生型转氨酶的酶活性。所述酶活性是指催化酮类化合物发生不对称转氨反应生成手性胺的酶活性。所述野生型转氨酶氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，且来源于土曲霉菌AspergillusterreusNIH2624。在本专利技术的一个具体实施例中，所述酶活性是指催化底物4-羟基-2-丁酮发生不对称转氨反应生成(R)-3-氨基丁醇的酶活性。所述改进的转氨酶是在SEQIDNo.2所示氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基衍生的具有转氨酶催化活性的蛋白质，且与SEQIDNo.2所示氨基酸序列有至少95％序列同源性。其中，所述的“几个”是指2-15个，更佳地小于10个。根据本专利技术，在如SEQIDNo.2所示氨基酸序列的蛋白质分子中进行2、5、10个氨基酸残基的突变得到SEQIDNo.4、6、8所示氨基酸序列的蛋白质均具有较高的转氨酶的活性。所述SEQIDNo.4是与SEQIDNo.2所示氨基酸序列有至少95％序列同源性的氨基酸序列，且对应于SEQIDNo.2所示氨基酸序列中的第55位和第215位分别为丙氨酸和脯氨酸。所述SEQIDNo.6是与SEQIDNo.2所示氨基酸序列有至少95％序列同源性的氨基酸序列，且对应于SEQIDNo.2所示氨基酸序列中的第54位、第55位、第117位、第161位和第215位分别为酪氨酸、丝氨酸、丙氨酸、亮氨酸和脯氨酸。所述SEQIDNo.8是与SEQIDNo.2所示氨基酸序列有至少95％序列同源性的氨基酸序列，且对应于SEQIDNo.2所示氨基酸序列中的第54位、第55位、第58位、第117位、第126位、第142位、第144位、第161位、第207位和第215位分别为酪氨酸、丝氨酸、丙氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、半胱氨酸和脯氨酸。在本专利技术的一个具体实施例中，所述的改进的转氨酶的氨基酸序列为SEQIDNo.4。在本专利技术的一个具体实施例中，该改进的转氨酶的酶活性是所述野生型转氨酶酶活性的至少2倍。本专利技术第二方面提供了编码上述改进转氨酶的基因，其包含与SEQIDNo.1所示的核苷酸序列有至少95％序列同源性的核苷酸序列。所述改进的转氨酶的编码基因的核苷酸序列可选自SEQIDNo.3、SEQIDNo.5和SEQIDNo.7.在本专利技术的一个具体实施例中，该改进的转氨酶的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。本专利技术第三方面提供了一种基因工程菌，该菌种表达上述改进的转氨酶。在本专利技术的一个具体实施例中，该基因工程菌所使用的表达载体为pET-24a，宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。本专利技术第四方面提供了一种本专利技术所述的改进的转氨酶在催化酮类化合物不对称转氨反应生成手性胺化合物中的应用。上述应用中，所述反应的各条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择，优选如下：在pH＝7-9的缓冲液中，分别添加一定比例的异丙胺、磷酸吡哆醛(PLP)、4-羟基-2-丁酮及本专利技术所述改进的转氨酶，在30-40℃下进行不对称转氨反应，生成光学活性的(R)-3-氨基丁醇。反应混合液中转氨酶的浓度为5-10g/L、异丙胺的浓度为60-90g/L、4-羟基-2-丁酮的浓度为25-50g/L、PLP的浓度为0.1-1mM以及缓冲液的浓度为10-100mM。反应时间以反应过程中产物浓度不再增加的时间为准。反应结束后，可按本领域常规方法从反应液中提取产物(R)-3-氨基丁醇。所述改进的转氨酶由基因工程菌发酵得到，以酶粉、转氨酶的细胞破碎液或者含酮还原酶的菌体细胞的形式加入，优选以酶粉形式加入。在本专利技术的一个具体实施例中，转氨酶酶粉可采用本领域常规的分子生物学、超声破碎及真空冷冻干燥方法制得。与现有技术相比，本专利技术提供了一种催化活性高、对映选择性强、底物耐受性好的改进的转氨酶，以及利用该转氨酶催化合成(R)-3-氨基丁醇的方法。该方法反应条件温和，产物手性纯度及收率均较高，同时底物浓度高达50g/L，大大提高了(R)-3-氨基丁醇的制备效率，降低其生产成本，具有较好的工业应用前景。附图说明图1为本专利技术实施例1中突变基因融合PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；图2为本专利技术实施例3中表达AtATmut转氨酶细胞破碎沉淀和上清液的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。A为破碎沉淀，B为破碎上清液。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术的
技术实现思路
作进一步的阐述，其目的是为了更好的理解本专利技术的内容，但本专利技术的保护范围不限于此。实施例1转氨酶突变体库的构建全基因合成序列如SEQIDNo.1所示核苷酸，选择NdeI和HindIII两个酶切位点插入pET24a表达载体，获得的重组表达载体命名为pET24a-AtAT。为构建突变体库，我们设计了以下6条引物，详见表1：表1PCR引物表以pET24a-AtAT为模板利用上述引物进行PCR扩增，PCR体系为：10×PCRbuffer为5uL，2.5mMdNTP为4uL，pfuDNAPolymerse为0.5uL，pET24a-AtAT模板为0.5uL(含DNA模板本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种改进的转氨酶，其特征在于：该改进的转氨酶的酶活性高于野生型转氨酶的酶活性；所述酶活性是指催化酮类化合物发生不对称转氨反应生成手性胺的酶活性；所述野生型转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，且来源于土曲霉菌Aspergillus terreus NIH2624；所述改进的转氨酶包含与SEQ ID No.2所示氨基酸序列有至少95％序列同源性的氨基酸序列，且对应于SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第215位为脯氨酸残基。

【技术特征摘要】
1.一种改进的转氨酶，其特征在于：该改进的转氨酶的酶活性高于野生型转氨酶的酶活性；所述酶活性是指催化酮类化合物发生不对称转氨反应生成手性胺的酶活性；所述野生型转氨酶的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，且来源于土曲霉菌AspergillusterreusNIH2624；所述改进的转氨酶包含与SEQIDNo.2所示氨基酸序列有至少95％序列同源性的氨基酸序列，且对应于SEQIDNo.2所示氨基酸序列中的第215位为脯氨酸残基。2.如权利要求1所述改进的转氨酶，其特征在于：所述酶活性是指催化4-羟基-2-丁酮发生不对称转氨反应生成(R)-3-氨基丁醇的酶活性。3.如权利要求1所述改进的转氨酶，其特征在于：所述改进的转氨酶的氨基酸序列选自SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：高新星，陆丽英，竺伟，
申请(专利权)人：尚科生物医药上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31