一种4-羟基异亮氨酸的合成方法技术

本发明专利技术涉及一种4‑羟基异亮氨酸的合成方法，该方法首先构建重组表达质粒，同时表达L‑异亮氨酸‑4‑羟基化酶和L‑谷氨酸氧化酶，然后在构建的催化反应体系中加入L‑谷氨酸和L‑异亮氨酸两种底物作为催化反应的前体合成4‑羟基异亮氨酸，经过4h的催化反应，L‑谷氨酸和L‑异亮氨酸的转化率分别为97.01％和98.45％。本发明专利技术使用L‑谷氨酸替代α‑酮戊二酸作为合成4‑羟基异亮氨酸的前体，能高效生产4‑羟基异亮氨酸且生产成本低，便于工业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及化合物生物技术生产领域，尤其是一种4-羟基异亮氨酸的合成方法。
技术介绍
在生物
中，尽管以大肠杆菌为宿主的相关克隆，表达技术已经非常成熟，但是异源蛋白的重组表达仍是一个重要的研究内容，为了提高重组蛋白的可溶性和表达量，需要大量时间和大量的实验室工作，经多次实验、再实验的努力才能达到最后的成功。4-羟基异亮氨酸(4-Hydroxyisoleucine，4-HIL)是一种主要存在于胡芦巴属植物种子中的L-异亮氨酸羟化物。4-HIL分子式C6H13NO3，分子量147.17，熔点大于200℃，沸点332℃，密度1.181g/cm3。研究表明4-羟基异亮氨酸具有葡萄糖浓度依赖的促进胰岛素分泌的活性以及促进肌细胞对血糖吸收、加速脂肪代谢、降血脂和保护肝功能的作用。因此，作为有效预防和治疗糖尿病及肥胖症的理想药物，4-羟基异亮氨酸具有广泛的应用前景和市场需求。4-羟基异亮氨酸的生产方法有提取法、化学合成法、酶催化法和生物法，目前工业化生产4-羟基异亮氨酸的技术已经较成熟，但主要是重葫芦巴中提取，其产品分离纯化困难，难以制备，产品纯度低，污染环境严重，大量制备成本高，且该法获得的4-羟基异亮氨酸构型较多，但仅(2S，3R，4S)-4-羟基异亮氨酸具有上述生物学活性，从而使得该方法存在提取率低(仅为0.091-0.6％)。随着生物技术的发展，在研究化学合成4-HIL的过程中尝试引入酶催
化反应来简化一些步骤。酶法合成4-羟基异亮氨酸作为一种新的合成4-羟基异亮氨酸方法，但是需要加入昂贵的α-酮戊二酸作为底物。Wang等于2002年专利技术了八步法合成4-HIL，该方法以2-甲基乙酰乙酸乙酯为原料，在地霉菌的作用下得到(2S，3S)-3-羟基-2-甲基丁酸乙酯，再经过7步化学合成将其转变成4-HIL。这其中借助地霉菌转化2-甲基乙酰乙酸乙酯是最关键一步。该方法总收率为39％，且反应条件苛刻、步骤多、而且容易引起环境污染，因此仍停留在实验室阶段。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种4-羟基异亮氨酸的合成方法。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：一种4-羟基异亮氨酸的合成方法，使用L-谷氨酸作为催化前体酶法合成4-羟基异亮氨酸，具体步骤如下：(1)构建包含L-异亮氨酸-4-羟基化酶和L-谷氨酸氧化酶基因重组表达载体；(2)将步骤(1)中的重组表达载体转化所需菌株，获得基因工程重组菌株；(3)培养步骤(2)中的重组菌株，从而获得表达L-异亮氨酸-4-羟基化酶和L-谷氨酸氧化酶的菌体；(4)破碎步骤(3)中的菌体，获得粗酶；(5)将步骤(4)中获得的粗酶添加入含有L-谷氨酸和L-异亮氨酸的催化液中，利用酶法合成4-羟基异亮氨酸。优选的，上述4-羟基异亮氨酸的合成方法，步骤(1)中以序列表<400>1和<400>2所示序列为已知ido和lgox原始核苷酸序列，序列表<400>3和<400>4所示序列为idol和lgox针对E.coli BL21(DE3)密码子优化的核
苷酸序列，构建得到包含L-异亮氨酸-4-羟基化酶(ido)和L-谷氨酸氧化酶(lgox)基因的重组表达载体——质粒pETduet-ido-lgox，所得质粒pETduet-ido-lgox的序列为序列表<400>5所示序列。优选的，上述4-羟基异亮氨酸的合成方法，步骤(2)中所述菌株为谷氨酸棒杆菌属(Corynebacterium gultamicum)、大肠杆菌(Escherichia coli)、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)、白色分枝杆菌属(Mycobacterium album)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)或蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)及韦氏芽孢杆菌(Bacillus weihenstephanensis)。优选的，上述4-羟基异亮氨酸的合成方法，所述步骤(5)中以L-谷氨酸和L-异亮氨酸为底物，利用所述步骤(3)生产的重组L-异亮氨酸-4-羟基化酶和L-谷氨酸氧化酶的整细胞为催化剂进行反应，反应初期调节pH2.0-10.0，反应总时间2-10h。优选的，上述4-羟基异亮氨酸的合成方法，所述底物L-谷氨酸和L-异亮氨酸作为催化底物其浓度分别为5-30g/L，重悬细胞的加入量为5-30g/L，反应温度为20℃-35℃，粗酶利用这两种底物合成4-羟基异亮氨酸。本专利技术的有益效果是：上述4-羟基异亮氨酸的合成方法，操作简单，利用L-谷氨酸代替α-酮戊二酸作为前体合成4-羟基异亮氨酸，可以在简单合成培养基中实现高密度培养，L-谷氨酸和L-异亮氨酸的转化率分别可达到91.2％-97.01％和93.5％-98.45％。附图说明图1为带6Xhis的表达质粒pETduet-ido-lgox。图2为pETduet-ido-lgox酶切验证图，其中，M:Marker；1:ido片段；2：lgox片段；3：pETduet BamHI单酶切；4：pETduet-ido-lgox BamHI单酶切；5：pETduet-ido-lgox BamHI、Hind III双酶切；6：pETduet-ido-lgox Bjl II、Xho I双酶切；7：pETduet-ido-lgox BamHI、Hind III、Bjl II、Xho I四酶切。图3为4-HIL标品、样品高效液相色谱图。具体实施方式为了使本领域的技术人员更好的理解本专利技术的技术方案，下面结合具体实施方式对本专利技术所述技术方案作进一步的详细说明。实施例1构建菌株E.coli BL21(DE3)/pETduet-ido-lgox并表达L-异亮氨酸-4-羟基化酶和L-谷氨酸氧化酶，利用底物L-谷氨酸和L-异亮氨酸酶法合成4-羟基异亮氨酸(1)获得ido和lgox核苷酸序列根据序列表<400>1和<400>2所示ido和lgox的核苷酸序列针对E.coli BL21(DE3)进行密子优化获得序列表<400>3和<400>4所示核苷酸序列。ido和lgox为外源基因，为增加其在宿主E.coli BL21(DE3)中的表达量，需对将其密码子优化为在宿主中使用频率最高的序列，其中，ido针对E.coli BL21(DE3)优化核苷酸序列，引物：上游引物：5'TATGGATCCATGAAAATGAGCGGTTTTAGCA 3'下游引物：5'CCCAAGCTTTTATTTGGTTTCTTTATAGCTAAAGGTC 3'lgox针对E.coli BL21(DE3)优化核苷酸序列，引物：上游引物：5'TAAAGATCTCTGCCGGCACCGGC 3'下游引物：5'ACTCTCGAGGGCGGTATGAATCTCTAATGCG 3'(2)质粒的构建分别用Ba本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种4‑羟基异亮氨酸的合成方法，其特征在于：使用L‑谷氨酸作为催化前体酶法合成4‑羟基异亮氨酸，具体步骤如下：(1)构建包含L‑异亮氨酸‑4‑羟基化酶和L‑谷氨酸氧化酶基因重组表达载体；(2)将步骤(1)中的重组表达载体转化所需菌株，获得基因工程重组菌株；(3)培养步骤(2)中的重组菌株，从而获得表达L‑异亮氨酸‑4‑羟基化酶和L‑谷氨酸氧化酶的菌体；(4)破碎步骤(3)中的菌体，获得粗酶；(5)将步骤(4)中获得的粗酶添加入含有L‑谷氨酸和L‑异亮氨酸的催化液中，利用酶法合成4‑羟基异亮氨酸。

【技术特征摘要】
1.一种4-羟基异亮氨酸的合成方法，其特征在于：使用L-谷氨酸作为催化前体酶法合成4-羟基异亮氨酸，具体步骤如下：(1)构建包含L-异亮氨酸-4-羟基化酶和L-谷氨酸氧化酶基因重组表达载体；(2)将步骤(1)中的重组表达载体转化所需菌株，获得基因工程重组菌株；(3)培养步骤(2)中的重组菌株，从而获得表达L-异亮氨酸-4-羟基化酶和L-谷氨酸氧化酶的菌体；(4)破碎步骤(3)中的菌体，获得粗酶；(5)将步骤(4)中获得的粗酶添加入含有L-谷氨酸和L-异亮氨酸的催化液中，利用酶法合成4-羟基异亮氨酸。2.根据权利要求1所述的4-羟基异亮氨酸的合成方法，其特征在于：步骤(1)中以序列表<400>1和<400>2所示序列为已知ido和lgox原始核苷酸序列，序列表<400>3所示序列为idol和lgox针对E.coli BL21(DE3)密码子优化的核苷酸序列，构建得到包含L-异亮氨酸-4-羟基化酶和L-谷氨酸氧化酶基因的重组表达载体——质粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢希贤，张成林，陈宁，麻杰，刘涛，徐庆阳，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12