扩增核酸的检测方法和检测装置制造方法及图纸

本发明专利技术的目的是提供核酸检测方法，和核酸检测装置或试剂盒，所述核酸检测方法有效利用杂交法的高特异性，并且减少PCR产物的检测步骤所需的时间和步骤，在不需要特殊装置的条件下，简便且高精度地进行目测检测。提供了检测样品中的目标核酸的方法以及检测装置，所述方法包括：在扩增目标核酸序列时，合成在两个末端添加了单链区域的、具有部分双链结构的扩增产物的步骤；和采用结合了所述扩增产物的单链区域和展开介质的核酸序列、以及结合了目标化合物的核酸序列来形成夹心杂交复合物的步骤。

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请日为2011年11月24日、申请号为201180056583.4的中国专利技术申请“扩增核酸的检测方法和检测装置”的分案申请。
本专利技术涉及扩增核酸的简便的检测方法及其装置。
技术介绍
特异性扩增目标核酸序列的方法已经成为了分子生物学研究领域、基因检查等临床应用领域中非常重要的技术。作为特异性检测通过核酸扩增方法获得的扩增产物的方法之一有如下方法：将包含目标序列的核酸片段固定在固相上并进行检测的方法。在该方法中，目标核酸被特异地捕获在固相上，通过清洗等可以容易地去除非特异性核酸序列，从而可以提高检测特异性。目前，使目标核酸捕获于固相的方法可列举利用能够形成特异性结合的抗原-抗体的组合、或配体-受体的组合的方法。例如，非专利文献1公开了使用引物扩增的PCR产物的检测方法，所述引物中的一条引物末端用生物素修饰，另一条引物用荧光物质修饰。在该方法中，使PCR产物与由链霉亲和素-琼脂糖形成的固相接触，通过形成链霉亲和素-生物素复合物与固相结合，并可以通过测量其荧光而检测目标扩增产物。但是，由于受到能够作为标记使用的抗原/抗体或配体/受体的组合的限制，实际上难以同时检测多个目标核酸。此外，荧光标记核酸较为昂贵也存在成本方面的问题。在固相上捕获目标核酸的其他方法还有将由具有与目标核酸互补的序列的寡核苷酸形成的探针固定在固相上，通过目标核酸与探针的杂交，将目标核酸间接固定在固相上的方法。在该方法中，检测由杂交体的形成所带来的信号强度。这类核酸解析方法可以通过改变探针序列而一次性分析多个目标序列。但是，对于在固相上使固定化了的探针与目标核酸杂交，一般地，通过热处理使PCR方法扩增了的双链核酸变性成为单链的步骤是必需的，加热处理不仅复杂，而且存在由于再退火导致杂交效率低下的问题。此外，单链DNA易于球形化，还具有检测灵敏度差的问题。专利文献1中公开了不进行加热处理、通过核酸酶处理来扩增单链核酸的方法，但是，其操作仍然复杂，仍然存在单链的球形化的问题。在核酸的检测方法中，作为操作性优异、迅速、简便的检测目标核酸的方法，有基于专利文献2记载的色谱的方法。该方法是如下基因检测方法，所述方法是在单个基因检测装置上，通过毛细管作用，使包含任意被提取的基因或其片段的液体样品移动，从而连续进行从细胞、病毒或细菌中提取基因的步骤、将任意被提取的基因片段化的步骤和检测步骤。可以判断是否存在目的基因，进一步鉴别它的种类。但是，专利文献2也是通过NASBA法扩增单链核酸。在使用单链核酸上的问题如前所述。为了解决上述问题，在专利文献3和专利文献4中，通过使引物区域的5’端具有抑制DNA聚合酶催化的核酸合成的非天然核酸标签、发夹结构或假结(シュードノット)结构，从而即使在PCR反应后也在双链核酸的一端保留了单链区域。由于仅使用特殊的引物进行PCR反应，就能够制备下述扩增产物，因此是有利的。所述扩增产物具在双链DNA的一个末端具有能够杂交的单链区域。但是，由于必须通过荧光标记、表面等离子体共振差异成像进行检测，因此高价的专用装置是必需的，在快捷性、简便性等方面存在问题。现有技术文献专利文献专利文献1日本特开平5-252998号公报专利文献2日本特开2006-201062号公报专利文献3国际公开第2006/095550号小册子专利文献4日本特开2009-296948号公报非专利文献非专利文献1Analytical biochemistry,193,231-235,(1991)
技术实现思路
专利技术要解决的问题由于在临床现场进行基因诊断或检查需要大型且高价的检查装置，需要检查时间，患者的检查费用、多次去医院就医的时间或负担较重。因此，出于确保检查的准确性，同时减轻患者和检查者负担的原因，需要简便、快速且特异性高的方法、以及低成本且不需要特殊装置的方法。本专利技术是针对上述问题进行的专利技术，其目的在于提供如下核酸检测方法和核酸检测装置或试剂盒，该方法为有效利用杂交法的高特异性，同时减少PCR产物的检测步骤所需的时间和步骤，在不需要特殊装置的条件下，简便且高精度地目测检测的核酸检测方法。进一步的，迄今为止需要针对每个目标核酸制备高价的标记标签，在劳动力和成本方法还有改良的余地。解决问题的方法本专利技术人等为了解决上述问题进行深入研究，结果独创性地发现：将目标核酸作为在两个末端分别具有单链区域的双链核酸进行扩增，使该扩增片段与具有能够与上述单链区域之一进行杂交的寡核苷酸探针的固相相结合，从而检测核酸，就可以在不需要特殊装置的条件下，简便且高精度的检测上述DNA扩增片段，从而完成了本专利技术。即，本专利技术涉及核酸检测方法，其包括：使双链DNA扩增片段的一个末端的单链区域与固定在固相上的第1寡核苷酸探针杂交的步骤，所述双链DNA扩增片段是在两个末端具有包含天然核苷酸的单链区域的双链DNA扩增片段。优选还包括使上述DNA扩增片段的另一个末端的单链区域与结合有标志物的第2寡核苷酸探针杂交的步骤。标志物优选包括着色担载体，并可以目测检测上述DNA扩增片段。优选包括在核酸检测装置上检测上述DNA扩增片段的步骤。优选用色谱检测上述DNA扩增片段。优选包括下述步骤(a)-(c)：(a)在上述核酸检测装置上的不同于固定有上述第1寡核苷酸探针的区域的区域中，配置上述DNA扩增片段的步骤，(b)使用溶剂，使上述DNA扩增片段在朝向固定有上述第1寡核苷酸探针的区域的方向上在上述装置上扩散的步骤，以及(c)在固定有上述第1寡核苷酸探针的区域中，使上述第1寡核苷酸探针与上述DNA扩增片段杂交的步骤。优选还包括在上述步骤(c)之前，使上述DNA扩增片段与结合有上述标志物的第2寡核苷酸探针杂交的步骤。优选：(d)在上述核酸检测装置上的不同于固定有上述第1寡核苷酸探针的区域的各个区域中，分别配置上述DNA扩增片段、以及结合有所述标志物的第2寡核苷酸探针，(e)使用溶剂，使上述DNA扩增片段在朝向配置有第2寡核苷酸探针的区域的方向上扩散，所述第2寡核苷酸探针结合有上述标志物，(f)在配置了结合有上述标志物的第2寡核苷酸探针的区域中，使上述DNA扩增片段与结合有标志物的第2寡核苷酸探针杂交，(g)使在步骤(f)中杂交而得到的复合物在朝向配置有上述第1寡核苷酸探针的方向上在展开介质上扩散，以及(h)在固定有上述第1寡核苷酸探针的区域中，使上述第1寡核苷酸探针与上述复合物杂交。上述包含天然核苷酸的单链区域优选是与双链DNA区域相同方向的序列。上述DNA扩增片段优选是使用2种下述引物且通过核酸扩增方法获得的产物，所述引物具有在核酸扩增反应中不被双链化的标签区域。上述DNA扩增片段优选是使用第1引物组和第2引物组且通过核酸扩增方法获得的产物，所述第1引物组包括下述引物，该引物具有能够与目标核酸的模板杂交的序列、和不能够与该模板杂交的共同序列，以及所述第2引物组包括下述引物，该引物具有能够与上述共同序列的互补序列杂交的序列、和在核酸扩增反应中不被双链化的标签区域。优选上述在核酸扩增反应中不被双链化的标签区域包括天然核苷酸，且第2引物组的引物全长为相同方向的序列。此外，本专利技术涉及在上述核酸检测方法中使用的核酸检测装置，其具有：配置上述DNA扩增片段的区域，保持有上述第1寡核苷酸探针的色谱担载体，所述第本文档来自技高网...

【技术保护点】
核酸检测方法，其包括下述步骤(1)‑(5)：(1)使用具有在核酸扩增反应中不被双链化的标签区域的引物，通过PCR法扩增目标核酸，得到具有包含天然核苷酸的单链区域的双链DNA扩增片段的步骤；(2)使用色谱作为核酸检测装置，对所述DNA扩增片段进行检测而不进行单链化处理的步骤；(3)在所述核酸检测装置上的不同于固定有所述第1寡核苷酸探针的区域的区域中，配置所述DNA扩增片段的步骤；(4)使用溶剂，使所述DNA扩增片段在朝向固定有所述第1寡核苷酸探针的区域的方向上在所述装置上扩散的步骤；以及(5)在固定有所述第1寡核苷酸探针的区域中，使所述第1寡核苷酸探针与所述DNA扩增片段杂交的步骤。

【技术特征摘要】
2010.11.24 JP 2010-261728;2011.06.28 JP 2011-143421.核酸检测方法，其包括下述步骤(1)-(5)：(1)使用具有在核酸扩增反应中不被双链化的标签区域的引物，通过PCR法扩增目标核酸，得到具有包含天然核苷酸的单链区域的双链DNA扩增片段的步骤；(2...

【专利技术属性】
技术研发人员：高桥孝治，宫本重彦，直原启明，友野润，
申请(专利权)人：株式会社钟化，
类型：发明
国别省市：日本;JP