乌梢蛇毛细管电泳DNA指纹图谱及鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种涉及中药材乌梢蛇DNA鉴定技术，该方法具体是SSR荧光标记乌梢蛇DNA毛细管电泳指纹图谱及鉴定方法。具有分辨率高、操作简便、快速、结果准确等特点，能够用于乌梢蛇样品的鉴定。

【技术实现步骤摘要】
乌梢蛇毛细管电泳DNA指纹图谱及鉴定方法
本专利技术涉及中药材鉴定技术，具体是SSR荧光标记乌梢蛇DNA毛细管电泳指纹图谱及鉴定方法。
技术介绍
乌梢蛇是我国传统名贵药材，《中国药典》(2015年版)规定其正品为游蛇科动物乌梢蛇Zaocysdhumnades(Cantor)的干燥体。多于夏、秋二季捕捉，剖开腹部或先剥皮留头尾，除去内脏，盘成圆盘状，干燥。有祛风，通络，止痉等功效。用于风湿顽痹，麻木拘挛，中风口眼哨斜，半身不遂，破伤风等。由于其养殖成本高、价格昂贵，而需求量极大，因此市售药材中常有混伪品充斥。乌梢蛇的现行质量评价方法有很多，传统鉴别是通过性状差异、理化方法进行区分，但主观性强，鉴别时间长、成本高。并且，乌梢蛇在干燥和制成饮片过程中性状的可塑性很大，导致理化性状鉴别效果不理想，难以满足对乌梢蛇鉴定的准确、快速和客观的要求。因此，为乌梢蛇的真伪鉴别提供一种简便实用、准确性高的方法尤为重要。DNA指纹鉴定是以DNA分子为标记的中药分子鉴定方法。生物体无论是在生长过程发育过程还是经过人为加工，DNA序列均不会变，并且特定的物种具有特定的DNA序列，因此这种方法特别适用。近年来，以SSR标记为基础的DNA指纹鉴定技术已趋成熟，并被广泛应用。SSR标记具有以下优点：(1)数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高；(2)具有多等位基因的特性，提供的信息量高；(3)以孟德尔方式遗传，呈共显性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种SSR荧光标记乌梢蛇DNA毛细管电泳指纹图谱及鉴定方法，以解决现有技术的缺陷。本方法分辨率高、灵敏度高、操作简便、快速、安全、结果准确，能够用于乌梢蛇样品的鉴定。本专利技术的目的是由以下技术方案来实现的：一种SSR荧光标记乌梢蛇DNA毛细管电泳指纹图谱的建立方法，其特征是，它包含下述步骤：1)DNA提取：取乌梢蛇片，按盐析法提取其DNA；2)PCR扩增：PCR总体积为10μl，包含1.0μl模板DNA、1.5mMMg2+、0.2mMdNTPs、正反向引物各0.5μM、5*SSR缓冲液2.0μl和TaqDNA聚合酶0.5U。对上述DNA进行扩增；3)PCR产物纯化：吸取稀释后的PCR产物1.0μl注入进样板，加灭菌双蒸水9.0μl使总体积至10μl，离心。再加入30μl乙醇乙酸钠，8℃、3600r/min离心30min。弃上清液，加入50μl70％乙醇漂洗１次，置于室温晾干。4)PCR产物鉴定：扩增产物进行毛细管电泳分析，记录电泳图谱；并构建乌梢蛇DNA指纹图谱。一种乌梢蛇DNA指纹鉴定方法，其特征是，它包含下述步骤：1)先建立乌梢蛇DNA标准指纹图谱，方法如下：(a)DNA提取：取乌梢蛇对照药材，按盐析法提取DNA；(b)PCR扩增：PCR总体积为10μl，包含1.0μl模板DNA、1.5mMMg2+、0.2mMdNTPs、正反向引物各0.5μM、5*SSR缓冲液2.0μl和TaqDNA聚合酶0.5U。对上述DNA进行扩增；(c)PCR产物鉴定：扩增产物进行毛细管电泳分析，记录电泳图谱；并构建乌梢蛇DNA指纹图谱。；2)测定样品DNA指纹图谱：以上述相同的方法测定待测乌梢蛇样品，得样品DNA指纹图谱；3)结果鉴定：利用相似度分析软件比较样品DNA指纹图谱与乌梢蛇DNA标准指纹图谱的相似度，根据相似度对乌梢蛇样品进行真伪鉴定。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点：1.本专利技术将SSR荧光标记技术数量丰富、多态性高的特点和高效毛细管电泳快速、分辨率高、灵敏度高的特点结合起来，并将其用于中药材乌梢蛇的DNA指纹图谱及指纹鉴定方法的建立，这在乌梢蛇鉴定的应用方面属于首创。2.本专利技术采用高效毛细管电泳技术分析PCR扩增产物，与目前常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，高效毛细管电泳具有灵敏度高、分辨率高、分析速度快、重复性和稳定性好、样品用量小、成本低、不使用放射性同位素和剧毒试剂等优点。3.本专利技术以乌梢蛇对照药材的原始电泳图谱构建乌梢蛇DNA标准指纹图谱，不进行人为的删减或修改，保证了指纹图谱的完整性，使鉴定结果更准确和客观。4.由于本专利技术DNA指纹图谱以图的形式表示，看起来比较直观、易懂；并由于对样品进行鉴定时利用相似度分析软件，根据相似度对乌梢蛇样品进行真伪鉴定，更容易实现自动化分析。附图说明图1乌梢蛇DNA标准指纹图谱具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步说明，下面实施例仅用于说明本专利技术而并非对本专利技术的限制。实施例1乌梢蛇毛细管电泳DNA指纹图谱的建立1.DNA提取取本品0.5g，置乳钵中，充分研磨使成粉末，取0.lg置1.5ml离心管中，加入消化液275μl，在55℃水浴保温1小时，加入裂解缓冲液250μl，混匀，加到DNA纯化柱中，离心（10000转/1分钟）3分钟；弃去过滤液，加人洗脱液800μl，离心(10000转/1分钟）1分钟；弃去过滤液，用上述洗脱液反复洗脱3次，每次离心(10000转/1分钟)1分钟；弃去过滤液，再离心2分钟，将DNA纯化柱转移人另一离心管中，加入无菌双蒸水100μl，室温放置2分钟后，离心（10000转/1分钟）2分钟，取上清液，作为供试品溶液，置-20℃保存备用。2.PCR扩增PCR总体积为10μl，包含1.0μl模板DNA、1.5mMMg2+、0.2mMdNTPs、正反向引物各0.5μM、5*SSR缓冲液2.0μl和TaqDNA聚合酶0.5U。对上述DNA进行扩增；循环参数设置为：94℃预变性5min，94℃变性80sec，36℃退火1min，72℃延伸2min，45个循环后72℃延伸10min。3.PCR产物鉴定将步骤2中的PCR扩增产物进行毛细管电泳分析，具体步骤如下：3.1仪器、试剂ABI3130XLDNA测序仪、乙酸钠（CH3COONa）、乙二胺四乙酸(EDTA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、磷酸二氢钠、氢氧化钠为分析纯、灭菌双蒸水。乌梢蛇对照药材(中国食品药品检定研究院121591-201201)，市售乌梢蛇(吉林市各大药店随机采购随机采购)，常见伪品乌梢蛇(吉林市药检所鉴定提供并坚定)。3.2电泳条件15kV下3min；电进样1.6kV下23s；正式毛细管电泳15kV下25min.4.记录乌梢蛇的电泳图谱，作为乌梢蛇DNA标准指纹图谱，此标准指纹图谱可用于乌梢蛇样品的鉴定(见图1)。实施例2将本专利技术的乌梢蛇DNA指纹鉴定方法用于某个乌梢蛇样品的鉴定假设现有一批乌梢蛇样品不能确定是否是真正的乌梢蛇，因此，按照如下方法对它进行鉴定。乌梢蛇DNA标准指纹图谱建立以后，要对某个样品进行鉴定时，首先用盐析法提取其线粒体DNA；用提取的DNA作为模板，用SSR引物对其进行PCR扩增；扩增产物进行毛细管电泳分析并记录电泳图谱，即得该批待测样品的DNA指纹图谱；利用相似度分析软件比较待测样品DNA指纹图谱与乌梢蛇DNA标准指纹图谱的相似度，根据相似度对待测样品进行鉴定。鉴定结果：若二者相似度大于90％(含90％)，这批样品就是真正的乌梢蛇；若二者相似度小于90％，那么这批样品就不是真正的乌梢蛇。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种中药材乌梢蛇DNA鉴定方法，其特征在于：所述方法利用SSR荧光标记与乌梢蛇DNA相结合，可以快速准确的鉴别乌梢蛇及其真伪。

【技术特征摘要】
1.一种中药材乌梢蛇DNA鉴定方法，其特征在于：所述方法利用SSR荧光标记与乌梢蛇DNA相结合，可以快速准确的鉴别乌梢蛇及其真伪。2.一种如权利要求1中所述中药材乌梢蛇DNA鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：1)DNA提取：取乌梢蛇片，按盐析法提取其DNA；2)PCR扩增：PCR总体积为10μl，包含1.0μl模板DNA、1.5mMMg2+、0.2mMdNTPs、正反向引物各0.5μM、5*...

【专利技术属性】
技术研发人员：苑广信，李梓僮，张丽华，王冰梅，付桂莲，李盈诺，孙云朋，王艳双，周亭亭，王雪松，张悦，杨雪，
申请(专利权)人：北华大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22