灰叶酸抑制真核细胞线粒体ATP生成的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种灰叶酸抑制真核细胞线粒体ATP生成的应用；灰叶酸作为真核细胞线粒体膜电位抑制剂的应用；灰叶酸作为线粒体氧化磷酸化抑制剂的应用。本发明专利技术提出了灰叶酸的新用途，这些用途基于其新的功能发现和证实。灰叶酸可剂量依赖性和时间依赖性地降低多种细胞的线粒体膜电位，细胞的ATP水平也随之下降，细胞的活性显著降低并最终死亡。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于灰叶酸应用
，具体涉及一种灰叶酸抑制真核细胞线粒体ATP生成的应用。
技术介绍
线粒体是细胞内负责能量生成的细胞器，对于细胞的功能状态至关重要。线粒体通过氧化磷酸化的方式把来源于葡萄糖和脂肪酸等产生的乙酰辅酶A通过三羧酸循环生成CO2，同时把氢离子通过递氢体沿呼吸链传递，在此过程中建立线粒体内膜两侧的氢离子浓度差，并将此势能差用于ATP生成。氢离子最后氧化生成水。线粒体膜电位是维持ATP生成的能量来源，膜电位消失将导致ATP生成减少，进而导致细胞因能量缺乏而死亡。灰叶酸(grifolic acid)属于酚类化合物，被作为游离脂肪酸受体激动剂或者拮抗剂而使用，通过检索国内外现有技术，尚未有文献报道灰叶酸的其它生物学效应。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种灰叶酸抑制真核细胞线粒体ATP生成的应用，为抑制癌细胞的增殖提供了新的思路。本专利技术所采用的技术方案是，灰叶酸抑制真核细胞线粒体ATP生成的应用。灰叶酸作为真核细胞线粒体膜电位抑制剂的应用。灰叶酸作为线粒体氧化磷酸化抑制剂的应用。本专利技术的有益效果是，本专利技术提出了灰叶酸的新用途，这些用途基于其新的功能发现和证实。灰叶酸可剂量依赖性和时间依赖性地降低多种细胞的线粒体膜电位，细胞的ATP水平也随之下降，细胞的活性显著降低并最终死亡。附图说明图1：灰叶酸降低真核细胞的线粒体膜电位：共聚焦显微镜拍摄人L2肝细胞的JC-1荧光强度的变化过程，分别为加药前(A)和20μmol/L灰叶酸处理5分钟(B)、10分钟(C)、20分钟(D)之后荧光强度变化；共聚焦显微镜拍摄小鼠Raw264.7巨噬细胞的JC-1荧光强度的变化过程，分别为加药前(E)和20μmol/L灰叶酸处理5分钟(F)、20分钟(G)、30分钟(H)；A-H图中的1号为585nm激光下荧光强度，2号为514nm激光下荧光强度；图2：灰叶酸降低真核细胞的线粒体膜电位的统计结果；不同细胞在不同浓度灰叶酸处理5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟和60分钟之后，细胞内JC-1红色荧光与绿色荧光比值相对于加药前的变化比例；A：人L2肝细胞；B：人胚肾HEK293细胞；C：人MCF-1乳腺癌细胞；D：大鼠GH3垂体细胞；E：大鼠肾NRK细胞；F：小鼠Raw264.7巨噬细胞，每组细胞数目n＝100；图3：灰叶酸减少真核细胞的细胞ATP水平；20μmol/L灰叶酸处理0.5小时后各种细胞的胞内ATP水平显著下降，并随时间延长至2小时后降低幅度显著增加(图A)；10μmol/L灰叶酸处理2小时和6小时后各种细胞的胞内ATP水平时间依赖性出现下降(图B)，每组细胞数n＝12；图4：灰叶酸诱导真核细胞死亡；不同细胞在不同浓度灰叶酸处理2小时、6小时、12小时和24小时之后，经MTT检测发生死亡的情况。A：人L2肝细胞；B：人胚肾HEK293细胞；C：人MCF-1乳腺癌细胞；D：大鼠GH3垂体细胞；E：大鼠肾NRK细胞；F：小鼠Raw264.7巨噬细胞；灰叶酸剂量依赖性和时间依赖性促进上述各种细胞的死亡，每组细胞数n＝16。具体实施方式下面结合具体的实施例对本专利技术做进一步的详细说明，所述是对本专利技术的解释而不是限定。一、细胞培养：人、大鼠和小鼠来源的多种细胞用于灰叶酸作用的检测。人L2肝细胞、人MCF-1乳腺癌细胞、人胚肾HEK293细胞、大鼠GH3垂体细胞、大鼠肾NRK细胞、小鼠Raw264.7巨噬细胞等用于检测。上述所有细胞均培养于含10％胎牛血清的DMEM培养液中，在37℃的5％CO2培养箱中培养，每2-3天更换培养液，细胞生长至80％后传代。传代用0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化后按照1:3～5比例传代。培养液和血清以及消化酶均为Gibco公司产品。二、细胞线粒体膜电位检测：将上述所有细胞种植于0.01％多聚赖氨酸包被的盖玻片上，第二天换至无血清培养液，培养液中加入JC-1(终浓度5μg/ml)进行负载20分钟，随后清洗去培养液中JC-1。细胞放置于共聚焦显微镜上，连续定时观察JC-1的荧光强度变化。JC-1荧光探针在线粒体膜电位较高时，可聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，产生红色荧光；JC-1在线粒体膜电位较低时，不能聚集在线粒体的基质中，此时成为单体，产生绿色荧光。这样就可通过红绿荧光的相对比例来衡量检测线粒体膜电位的变化。JC-1荧光强度记录图如图1所示，由图1可见JC-1荧光强度随灰叶酸处理时间延长而在585nm出现下降，在514nm出现增强，说明JC-1从线粒体漏出到细胞浆内，说明细胞的线粒体膜电位下降。对每个细胞的荧光强度进行测量后进行比值分析，采用方差分析对各组间荧光比值进行统计学分析。结果如图2所示。例如，在人L2肝细胞，灰叶酸在20μmol/L的浓度处理5分钟后，细胞即可出现显著的JC-1红色荧光强度减弱，绿色荧光强度增强，说明线粒体膜电位开始减小。20μmol/L灰叶酸处理30分钟后，JC-1红绿荧光比值降至最低。10μmol/L灰叶酸在处理5分钟后起效，并随时间延长而效果更加明显，其消除线粒体膜电位的作用较20μmol/L灰叶酸为弱。5μmol/L灰叶酸在10分钟后起效，其削弱线粒体膜电位的作用较10μmol/L灰叶酸为弱。2.5μmol/L灰叶酸的作用则进一步减弱，1.25μmol/L灰叶酸在1小时之内未见对线粒体膜电位有显著的影响。虽然灰叶酸在不同细胞的作用效果有所不同，但是在2.5μmol/L及以上的浓度下，灰叶酸在所测试的细胞均有降低线粒体膜电位的作用，且作用具有时间依赖性和剂量依赖性。三、细胞内ATP水平检测：上述所培养的各种细胞种植于24孔培养板中，待生长至90％之后，更换至无血清培养液，分别加入不同浓度灰叶酸，在作用0.5小时、2小时、6小时后去除上清液，加入细胞裂解液。冰冷状态下裂解收取细胞液，用于ATP水平测定。ATP水平采用化学发光法测定，具体步骤如下：在化学发光板中每孔加入100μl的ATP检测工作液，室温放置5分钟，随后用排枪迅速分别在每孔加入检测样本或者标准品20μl，放置20秒后，放置于化学发光仪上测定发光亮度。根据标准曲线计算各个样本的ATP水平，进行统计学分析。具体结果如图3所示。20μmol/L灰叶酸作用0.5小时后，在人L2肝细胞即可见到显著的ATP水平下降，2小时后更为明显。10μmol/L灰叶酸的作用较20μmol/L灰叶酸为弱，在2小时也可引起显著ATP水平下降，在6小时后作用更为明显。四、细胞活性检测：上述所培养的各种细胞种植于96孔培养板中，待生长至90％之后，更换至无血清培养液，分别加入不同浓度灰叶酸，孵育2小时、6小时、12小时、24小时。随后加入MTT(终浓度0.5mg/ml)。MTT可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的针状结晶并沉积在细胞中，结晶物能被DMSO溶解，用酶联免疫检测仪在560nm波长处测定其光吸收值，可反映细胞数量。在MTT孵育4小时后，完全去除上清液，每孔加入100μl的DMSO，应用酶标仪在560nm处读取吸光度(OD值)。采用方差分析对各组的OD值进行统计学分析。具体结果如图4所示本文档来自技高网...

【技术保护点】
灰叶酸抑制真核细胞线粒体ATP生成的应用。

【技术特征摘要】
1.灰叶酸抑制真核细胞线粒体ATP生成的应用。2.灰叶酸作为真核细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵玉峰，王莉，苏兴利，徐曦，刘珂，陈镝，刘英光，谢荣，梁向燕，
申请(专利权)人：西安医学院，
类型：发明
国别省市：陕西;61