抑制Hmga2基因表达的双链siRNA制造技术

本发明专利技术公开了一种siRNA序列，具体为一种抑制Hmga2基因表达的双链siRNA序列，能抑制肿瘤细胞和血管内皮细胞的迁移，是很好的治疗肿瘤的药物。

Double stranded siRNA that inhibits the expression of Hmga2

The invention discloses a siRNA sequence, in particular to a double stranded siRNA sequence that inhibits the expression of Hmga2 genes, and can inhibit the migration of tumor cells and vascular endothelial cells, and is a good medicine for treating tumors.

【技术实现步骤摘要】
抑制Hmga2基因表达的双链siRNA本申请是“一种抑制Hmga2基因表达的双链siRNA及其应用”的分案申请，原申请的申请日为2010年11月24日，申请号为:201010575237.4。
本专利技术涉及siRNA双链序列及其应用，尤其是抑制Hmga2基因表达的双链siRNA及其抗肿瘤应用。
技术介绍
RNAi是一种在生物体细胞内，由特异的内源性或外源性双链RNA (doublestranded RNA, dsRNA)诱发其同源mRNA降解的基因沉默机制。RNAi现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。将与靶基因mRNA存在同源互补序列的dsRNA导入细胞后，能特异性地降解该mRNA，产生相应的功能表型缺失。RNAi首先由Fire等发现于秀丽隐杆线虫中，他们发现将dsRNA注入线虫体内后可抑制序列同源基因的表达，并证实这种抑制主要作用于转录之后，所以又将RNAi称为转录后基因沉默(PTGSKFire etal.，1998，FEBS Lett.2007Jul]。RNAi广泛存在于生物界，从低等原核生物，到植物、真菌、无脊椎动物，甚至哺乳动物。研究发现对哺乳动物细胞，最有效的是21~23个碱基大小，3’端有两个突出碱基的siRNA。RNAi是dsRNA介导的转录后沉默，具有强大的细胞穿透能力，可在不同细胞间长距离传递和维持。RNAi效应具有两个明显的特征，特异性和高效性。siRNA的序列专一性要求非常严谨，与靶mRNA之间一个碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果。因此，有效的RNAi依赖于siRNA的准确设计。siRNA的基因沉默效应取决于其靶基因序列的选择，任一碱基的错配都会导致RNAi效率减弱甚至丧失，这种高度的序列特异性使其对点突变、序列插入和缺失的选择性基因沉默具有明显的药理作用。siRNA主要通过脂质体转染、电穿孔、微注射以及质粒、病毒载体导入。RNAi技术发展至今已经超过10年，其在肿瘤中的研究也已经展开，RNAi的靶基因包括癌基因、甲基化相关基因、旁分泌/自分泌环、抗凋亡基因、血管形成相关基因、组织基质金属蛋白酶家族、细胞周期调控相关基因、癌转移相关基因、多药耐药相关基因等[Phalon et al.Expert Rev Mol Med.2010Augl8; 12:e26;Vazquez-Vega et al.Rev Invest Clin.2010;62(I):81-90]?Hmga2是人Hmga基因家族的3个主要成员之一。HMGA蛋白家族是一类以AT-hooks的高度保守的DNA结合基序和一个酸性拖尾为特征的小分子非组蛋白染色体蛋白。它们通过识别特定的DNA结构而不是一种特异的核苷酸序列来优先地结合到DNA中AT丰富的小沟内。由于HMGA蛋白家族具有通过改变染色体结构而调节很多目的基因表达的能力，使其通常被认为是结构性转录因子[Reeveset al.Environ Health Perspect, 2000,108(Suppl5):803-809]。HMGA参与转录调节、胚胎形成、分化、致瘤性转化、病毒基因组的整合和表达等不同的生物学过程。人的Hmga2基因位于12号染色体的ql5区,5个外显子的跨度接近160kb,蛋白结构由109个氨基酸组成，其中外显子1、2、3编码的序列中各含一个AT hook。外显子4和5分别编码连接区和酸性区。这三个碱性八肽的DNA结合基序都能与DNA分子小沟内的AT丰富区结合，因而称为AT hook,其核心结构是BBXRGRXB (B代表碱性氨基酸K或R，X是甘氨酸或脯氨酸)。其中基序中间的保守RGR序列在HMGA2与DNA结合中至关重要。尽管单个DNA结合基序的结合特异性不高，但是如果结合其上的DNA存在间隔一定序列的AT丰富区，则由于多个基序与一个DNA分子结合而使亲和力大大提高。HMGA2在正常生理活动中发挥着重要作用，当它出现异常时，就会导致疾病发生。1985年，在被病毒转化的大鼠甲状腺细胞株中，Giancotti发现了 HMGA2，并首次将它与肿瘤联系起来[Giancotti et al.Cancer Res, 1985,45 (12Ptl):6051-6057]。后期研究认为，HMGA2基因重排产生的突变蛋白与良性肿瘤有关，如脂肪瘤、肺部软骨错构瘤、多形性腺瘤、子宫平滑肌瘤；而全长蛋白过表达与恶性肿瘤发生发展有关。Hmga2在肺癌、乳腺癌、胰腺癌、白血病等大多数恶性肿瘤中均过表达，HMGA2蛋白的含量与肿瘤的进展相关。Hmga2是最近国内外研究较多的一个基因，除了在多种肿瘤中过度表达外，还与--!分期、淋巴结转移等肿瘤事件息息相关，并被认为在表皮间质转化(EMT)过程中起到重要作用。它可以调控包括 Snaill、Snail2、Twist、Id2 等蛋白的转录从而影响 EMT 进程[Thuault et al.J CellBiol, 2006，174(2):175-183]。目前，针对HMGA2的研究逐渐增多，HMGA2参与多个与肿瘤发生发展相关的生理病理过程，因此，HMGA2有望成为肿瘤治疗的一个新靶点。针对Hmga2展开治疗的主要手段有反义核苷酸和RNAi干扰技术。Pentimalli等用腺病毒携带HMGA2反义核苷酸进入高分化脂肪肉瘤细胞，能够引起HMGA2阳性细胞的生长抑制，并诱导其凋亡，但对HMGA2阴性的癌细胞则没有相应作用[Pentimalli et al.Cancer Res, 2003,63 (21):7423-7427.]。Malek等用siRNA沉默HMGA 2 (1146-1164)，能够导致卵巢癌细胞株周期阻滞与凋亡，还能够抑制0vcar-3细胞在小鼠体内移植瘤的生长[Malek et al.1nt J Cancer, 2008,123 (2):348-356.]。siRNA还被用于沉默胚胎干细胞中Hmga2基因的表达。此外，HMGA23’UTR具有众多的microRNA结合位点，特别是7个保守的Let_7结合位点，为针对HMGA2的microRNA药物开发提供了合适的靶点。Yu等就使用let-7来抑制HMGA2，从而抑制乳腺癌的发生[Yuet al.Cell,2007，131(6):1109-1123]。本专利技术设计提供了一组针对Hmga2基因的siRNA，通过筛选得到Hmga2siRNAl(990-1008)、Hmga2siRNA2 (1051-1069 )、Hmga2siRNA3 (1113-1131)三对新的有效 siRNA 序列。所说三对针对Hmga2的siRNA，不但能直接抑制多种肿瘤细胞的增殖，还有削弱内皮细胞的增殖和迁移的能力。因此，本专利技术提供的三对新的有效siRNA可以从抗肿瘤本身和抗血管形成两个方面发挥治疗作用，具有广谱抗肿瘤功效。本专利技术提供的所述三对针对Hmga2的siRNA，迄今为止尚未见有国内外的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种抑制Hmga2基因表达的双链siRNA及其应用。三对siRNAl、2、3序列都能抑制肿瘤细胞和血管内皮细胞的迁移，是很好的治疗肿瘤的药物。为了达成上述目的，本专利技术的解决方案是:一种抑制Hmga2基因表达的双链siRNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
抑制Hmga2基因表达的双链siRNA，其特征是：其核苷酸序列如下：siRNA3：正义链5“?GGAGGAAACUGAAGAGACAtt?3’，?????????反义链5“?UGUCUCUUCAGUUUCCUCCtt?3’。

【技术特征摘要】
1.抑制Hmga2基因表达的双链siRNA，其特征是:其核苷酸序列如下:siRNA3:正义链 5’ -GGAG...

【专利技术属性】
技术研发人员：王启钊，刁勇，许瑞安，
申请(专利权)人：华侨大学，
类型：发明
国别省市：