基于高通量测序技术的小麦病原微生物检测方法及其应用技术

本申请公开了一种基于高通量测序技术的小麦病原微生物检测方法及其应用。本申请的检测方法，包括1)提取待检小麦或小麦筛下物的基因组DNA；2)采用真菌ITS区通用引物对基因组DNA进行PCR扩增建库；3)高通量测序；4)将高通量测序结果根据97％以上相似性进行聚类分析，根据分类单元分析取待检小麦样品或小麦筛下物样品的病原微生物群落。本申请的检测方法，利用高通量测序技术，对小麦或小麦筛下物的基因组DNA进行测序，并通过生物信息学分析得到OTU，全面的分析出小麦携带病原真菌情况，为评估其有害性和风险性奠定了基础，特别适用于进出境检验检疫等部门，以突破或制定出相应的技术壁垒，保障小麦生产和贸易的安全。

Method for detecting pathogenic microorganism of wheat based on high throughput sequencing technology and its application

The invention discloses a method for detecting pathogenic microorganism of wheat based on high throughput sequencing technology and its application. Detection method of the application, including 1) genomic DNA tested wheat or wheat siftage; 2) using the fungus ITS primers for PCR amplification of genomic DNA database; 3) high-throughput sequencing; 4) the result of the high-throughput sequencing of cluster analysis according to the similarity of more than 97%, according to the pathogenic microorganisms the community tested samples of wheat or wheat siftage sample classification unit. The detection method for the use of high-throughput sequencing technology on wheat or wheat genomic DNA siftage were sequenced and OTU by bioinformatics analysis, a comprehensive analysis of wheat carrying pathogenic fungi, in order to evaluate the laid the foundation for its harmful and risk, especially for the inspection and quarantine departments in to break or exit, formulate corresponding technical barriers, protection of wheat production and trade safety.

【技术实现步骤摘要】

本申请涉及小麦病原微生物检测领域，特别是涉及一种基于高通量测序技术的小麦病原微生物检测方法及其应用。
技术介绍
中国是最大的小麦进口国，小麦进口量呈逐年增长态势。小麦上携带的病原真菌通过贸易方式传入、定殖会对我国的农业生产安全带来很大的风险。目前，全世界小麦上病害有200多种，其中可以通过输入小麦传播的有25种病原物，4种检疫性病原物，此外还有一些潜在风险的病原物，这些种传病害经由贸易途径传带，是植物检疫和农业主管部门重点关注的对象。目前，对小麦病原微生物的检测主要有形态学、生化学、血清学和分子生物学方法。这些检测手段大多都是基于对病原菌分离培养后的分析。以世界范围内广泛关注的检疫性病原真菌—小麦印度腥黑穗病菌检疫鉴定的国际标准(ISPM27.2006Annex4：TilletiaindicaMitra(2004-014))和国家标准(GB/T28080-2011)为例，样品前处理需先将冬孢子洗涤下来，再进行形态学和分子生物学的鉴定。正如已被分离培养的微生物只是微乎其微的极少部分，被人们分离培养并认知的病原微生物同样极少。专性寄生、培养条件苛刻、生长速度慢、在群体中丰度低、特殊生态要求等影响了病原微生物的分离培养，而这些限制就对研究病原菌的分类、多样性、致病机理、检测方法、风险分析及防控措施提出了挑战。在植物检疫领域，检疫性物种及其近似种的区分、重要有害生物的漏检、检疫处理措施的制定等都受到微生物不能分离培养的制约，这一限制性因素对检测方法的制定和结果的判定又有着更特殊、更重要的意义。因此，亟需对小麦上这些因不能分离培养的病原微生物进行认识和分析，评估其有害性和风险性，在传统风险分析的基础上，补充提出重点关注的有害生物名单，应对国际植物及植物产品贸易中的技术壁垒。高通量测序技术具有高效、快速、廉价并全面分析复杂的核苷酸的功能。目前，高通量测试技术已经应用于临床医学，用以对疾病或用药相关基因的突变进行全面检测，进而指导用药和预后。但是，在小麦病原微生物检测方面，尚没有利用高通量测序技术的高通量优势进行病原微生物检测的研究和报道。
技术实现思路
本申请的目的是提供一种基于高通量测序技术的小麦病原微生物检测方法及其应用。为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：本申请一方面公开了基于高通量测序技术的小麦病原微生物检测方法，包括以下步骤，1)提取待检小麦样品或小麦筛下物样品的基因组DNA；2)采用真菌ITS区通用引物对步骤1)的基因组DNA进行PCR扩增建库；3)对步骤2)的PCR扩增产物进行高通量测序；4)将高通量测序结果根据97％以上相似性进行聚类分析，根据获得的分类单元分析取待检小麦样品或小麦筛下物样品的病原微生物群落。需要说明的是，本申请的检测方法，创造性的将高通量测序技术引入小麦病原微生物的检测，通过对基因组DNA进行ITS区测序和聚类分析，可以全面掌握小麦上所携带的几乎所有病原微生物种类。本申请的检测方法为全面的认识和分析小麦病原微生物奠定了基础，进而为评估其有害性和风险性，在传统风险分析的基础上，补充提出重点关注的有害生物名单，应对国际植物及植物产品贸易中的技术壁垒提供了有力的科学依据。优选的，本申请的小麦病原微生物检测方法，还包括将步骤4)分析获得的病原微生物群落在目或属的分类水平上，将其分为优势类群、常见类群、次常见类群和稀有类群四大类；优势类群为比例大于或等于总病原微生物群落10％的真菌群落；常见类群为比例大于或等于总病原微生物群落1％，并小于10％的真菌群落；次常见类群为比例大于或等于总病原微生物群落0.5％，并小于1％的真菌群落；稀有类群为比例小于总病原微生物群落0.5％的真菌群落。需要说明的是，在本申请的一种实现方式中，对进境小麦分析获得了622个分类单元(缩写OTU)，这622个OTU分属于5个门64个目201个属的真菌；为了便于分析和认识，本申请创造性的提出将分析获得的病原微生物群落分别在不同分类水平上将其分为优势类群、常见类群、次常见类群和稀有类群四大类，以便于深入研究。本申请的另一面公开了本申请的小麦病原微生物检测方法在进境小麦样品检测中的应用。本申请的另一面公开了高通量测序技术在进境澳大利亚小麦病原微生物检测中的应用，包括采用本申请的小麦病原微生物检测方法对进境澳大利亚小麦或其筛下物中所携带的病原微生物群落进行全面分析和检测。需要说明的是，本申请的一种实现方式中，对进境澳大利亚小麦进行了病原微生物检测，分析获得了分属于5个门64个目201个属的真菌，为全面了解进境澳大利亚小麦上所携带的病原微生物打下了坚实的基础。由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：本申请的基于高通量测序技术的小麦病原微生物检测方法，利用高通量测序技术，对小麦或小麦筛下物的基因组DNA进行测序，并通过生物信息学分析得到OTU，进而全面的分析出小麦所携带的病原真菌情况，进而为评估其有害性和风险性奠定了基础。本申请的检测方法特别适用于进出境检验检疫等部门，以便于全面的了解小麦病菌携带情况，进而突破或制定出相应的技术壁垒，保障小麦生产和贸易的安全。附图说明图1是本申请实施例中8个样本的真菌稀释曲线；图2是本申请实施例中8个样本的Shannon-Wiener曲线。具体实施方式本申请的关键在于将高通量测序技术应用于小麦病原微生物的检测，基于高通量测序技术，通过对测序结果进行生物信息学分析，可以全面的了解小麦所携带的病原微生物情况，为评估其有害性和风险性，补充提出重点关注的有害生物名单，应对国际技术壁垒提供了有力的科学依据。需要说明的是，过去我们对病原微生物的学习和认识多从分类的角度入手，研究某一种病原物的分类、形态特征、寄主范围、危害性状等。而在植物病理学家、植物保护和植物检疫工作人员鉴定病原种类时，通常以某一特定感病植株的分析入手。前者侧重分类，是由点及面，并且主要是方法学层面；后者侧重性状，是由表及里，主要是系统论层面。本申请借鉴环境群体微生物生态学的思路，将一植物上的所有病原微生物视为一个群体，对其多样性进行研究可以知晓其致病微生物的种类和数量，分析不同病原菌之间的生态关系是否对侵染、定殖、致病产生影响。因此，本申请的小麦病原微生物检测方法，对掌握进口小麦或小麦产品上病原物的多样性，对其进行风险评估，进而提出和完善重点关注有害生物名单，甚至突破技术壁垒，制订新的技术壁垒等，都具有重大意义。还需要说明的是，在研究植物病原微生物多样性时会遇到两个问题：一是微生物多样性的特殊性，不同产地、不同品种的同一种植物上的病原种类和数量都不同。某一特定的寄主上的病原物多样性受内、外多种因素影响，内在因素有种子健康情况、植物生长发育阶段、生长健康程度等，外界因素有自然条件，如水分、空气、温度等环境因子，某一病原物的近似寄主，田间管理措施，如杀菌剂的使用、病原物其他寄主的清除、灌溉情况等。第二个问题是，正如已被分离培养的微生物只是微乎其微的极少部分，目前，已知细菌4760种，估计总种数40000种，被分离培养的只有约12％；已知真菌72000，估计总种数1.5×106种，被分离培养的只有约5％，被人们分离培养并认知的病原微生物同样极少。专性寄生、培养条件苛刻、生长速度慢、在群体中的丰度低、特殊生态关系等影响了本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于高通量测序技术的小麦病原微生物检测方法，其特征在于：包括以下步骤，1)提取待检小麦样品或小麦筛下物样品的基因组DNA；2)采用真菌ITS区通用引物对步骤1)的基因组DNA进行PCR扩增建库；3)对步骤2)的PCR扩增产物进行高通量测序；4)将高通量测序结果根据97％以上相似性进行聚类分析，根据获得的分类单元分析取待检小麦样品或小麦筛下物样品的病原微生物群落。

【技术特征摘要】
1.一种基于高通量测序技术的小麦病原微生物检测方法，其特征在于：包括以下步骤，1)提取待检小麦样品或小麦筛下物样品的基因组DNA；2)采用真菌ITS区通用引物对步骤1)的基因组DNA进行PCR扩增建库；3)对步骤2)的PCR扩增产物进行高通量测序；4)将高通量测序结果根据97％以上相似性进行聚类分析，根据获得的分类单元分析取待检小麦样品或小麦筛下物样品的病原微生物群落。2.根据权利要求1所述的小麦病原微生物检测方法，其特征在于：还包括将步骤4)分析获得的所述病原微生物群落在目或属的分类水平上，将其分为优势类群、常见类群、次常见类群和稀有...

【专利技术属性】
技术研发人员：程颖慧，王颖，史亚千，高瑞芳，汪莹，
申请(专利权)人：深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，深圳市检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44