一种用于非洲猪瘟病毒检测的试剂、检测方法及应用技术

本申请公开了一种用于非洲猪瘟病毒检测的试剂、检测方法及应用。本申请的非洲猪瘟病毒检测试剂，包括特异性引物对和探针，引物对的上下游引物分别为Seq ID No.1和2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列或其反向互补序列；SEQ ID No.3所示探针序列中，第28碱基修饰荧光淬灭基团‑dT，第31碱基替换为碱基类似物，第33碱基修饰荧光基团‑dT，3’末端修饰C3 Spacer。本申请的试剂，通过重组酶聚合酶扩增对非洲猪瘟病毒进行敏感、特异、高效检测；与现有常规或实时荧光PCR相比，本申请试剂和检测方法，检测时间短，操作简便，特别适于现场检测，对非洲猪瘟病毒快速防控，保障生产安全具有重大意义。

A Reagent, Detection Method and Application for Detection of African Swine Fever Virus

This application discloses a reagent, detection method and application for the detection of African swine fever virus. The African swine fever virus detection reagent in this application includes specific primer pairs and probes. The upstream and downstream primers of the primer pairs are Seq ID No.1 and 2, and the probe is Seq ID No.3 or its reverse complementary sequence. In the probe sequence shown in SEQ ID No.3, the 28th base modified fluorescence quenching group dT, the 31st base replaced by base analogue, and the 33rd base modified fluorescence. Optical group dT, 3'end modified C3 Spacer. This reagent is sensitive, specific and efficient for detection of African swine fever virus by recombinant enzyme polymerase amplification. Compared with conventional or real-time fluorescent PCR, this reagent and detection method have the advantages of short detection time, simple operation, especially suitable for on-site detection. It is of great significance for rapid prevention and control of African swine fever virus and ensuring production safety.

【技术实现步骤摘要】
一种用于非洲猪瘟病毒检测的试剂、检测方法及应用
本申请涉及非洲猪瘟病毒检测领域，特别是涉及一种用于非洲猪瘟病毒检测的试剂、检测方法及应用。
技术介绍
非洲猪瘟(Africanswinefever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFvirus，ASFV)感染引起的猪的一种急性、烈性、高度传染性疾病，以高热、网状内皮系统出血和高死亡率为特征。ASFV超强毒株感染可导致猪在12～14天内100％死亡，中等毒力毒株感染猪的死亡率一般为30％～50％，对养猪业危害巨大。世界动物卫生组织(OIE)将非洲猪瘟列为重要动物传染病，我国农业农村部将其列为一类动物疫病。ASFV是非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)的唯一成员，是一种具有二十面体形态的有包膜的双链DNA病毒，平均直径约为200nm，不同分离株的基因组长度在170-190kb之间变化，具有共价的闭合末端、反转重复区和发夹结构。ASFV是目前唯一已知核酸为DNA的虫媒病毒，只有一个血清型，可分为22个基因型。病毒粒子的主要结构组分，如p72、p24、p12、p17和p37等分别参与病毒吸附、侵入宿主靶细胞、参与病毒复制、调节宿主功能、参与早期mRNA的合成与加工、参与病毒形态形成等功能。P72蛋白是ASFV的主要结构蛋白，由基因B646L编码，该基因高度保守，是病毒检测中最常用的靶基因。ASF最早发生于肯尼亚，随后逐渐在非洲、美洲和欧洲的多个国家流行，近十年来，全球已有四十多个国家报告发生ASF疫情。2018年非洲猪瘟疫情在全球比较活跃，全球共有俄罗斯、罗马尼亚、波兰等22个国家报告发生5900多起疫情。2018年8月3日，辽宁省沈阳市沈北新区发生一起生猪非洲猪瘟疫情，这是我国首次发生非洲猪瘟疫情。截至2019年1月10日，全国共有23个省份72市县发生近百起非洲猪瘟疫情，因非洲猪瘟疫情累计扑杀生猪八十多万头。由于目前尚无有效的治疗方法或疫苗来预防ASF，一旦发生疫情很难根除和净化，只能通过执行严格的卫生防疫措施，扑杀染疫动物控制疫情蔓延。我国既是养猪大国，也是猪肉消费大国，猪肉年消费量超过5000万吨，非洲猪瘟疫情的防控成效对我国社会和谐稳定及养猪业的发展至关重要。当前我国非洲猪瘟疫情处于点状散发状态，且发生势头开始减缓，疫情总体可控。但同时，传统养殖结构难以短时间内根本改变，疫情传播途径错综复杂，防控形势仍然复杂严峻，快速高效的现场检测对非洲猪瘟疫情防控具有重要意义。
技术实现思路
本申请的目的是提供一种用于非洲猪瘟病毒检测的试剂、检测方法及其应用。本申请采用了以下技术方案：本申请的一方面公开了一种用于非洲猪瘟病毒检测的试剂，该试剂包括用于重组酶聚合酶扩增的非洲猪瘟病毒特异性引物对和探针，探针在引物对的扩增靶标区域内，引物对的上游引物为SeqIDNo.1所示序列，下游引物为SeqIDNo.2所示序列，探针为SeqIDNo.3所示序列或者SeqIDNo.3所示序列的反向互补序列；SeqIDNo.1：5’-TATTGTGAGAGTTCTCGGGAAAATGTTGTG-3’SeqIDNo.2：5’-CATTCATGATTTGCACAAGCCGCACCAAAGC-3’SeqIDNo.3：5’-GGAATTTCGGGTTGGTATGGCTGCACGTTCGCTGCGTATCATTTTCAT-3’其中，SEQIDNo.3所示的探针序列中，第28个碱基修饰荧光淬灭基团-dT，第31个碱基替换为碱基类似物，第33个碱基修饰荧光基团-dT，3’末端修饰C3Spacer。需要说明的是，本申请的试剂中，引物对和探针是针对非洲猪瘟病毒设计的，是特别用于重组酶聚合酶扩增的引物和探针。重组酶聚合酶扩增，缩写RPA，是英国TwistDx公司开发的一种新型的核酸等温扩增技术；该技术的关键之一是设计合适的扩增引物对和探针。但是，常规PCR引物对和探针并不适合RPA；常规PCR的引物相对太短、重组效率低；常规的探针系统，与RPA也不兼容。因此，无法通过常规的引物或探针设计软件直接输出适用于RPA的引物对和探针。目前设计RPA引物对和探针，主要根据TwistDx公司网站上提供的筛选指南，人工设计多条特异性引物和探针进行试验筛选，以获得扩增效率高、灵敏度高、特异性强的引物和探针。本申请的一种实现方式中，分别设计了2条RPA探针，并针对每条探针分别设计了3条上游引物和3条下游引物，用于试验筛选，最终筛选出SeqIDNo.1所示序列和SeqIDNo.2所示序列的引物对，以及SEQIDNo.3所示序列的探针，作为本申请的非洲猪瘟病毒检测试剂。还需要说明的是，RPA的原理是采用三个酶，在恒温下使一对引物对靶标进行指数扩增；本申请的试剂中，考虑到通过荧光检测的方式对RPA扩增产物进行检测，因此，在一对特异性引物的基础上提供了相应的特异性探针。可以理解，RPA扩增产物也可以采用其它方式，例如侧流层析试纸条、生物芯片、凝胶电泳等进行检测；因此，如果不采用荧光检测，则可以不使用SEQIDNo.3所示序列的探针。也就是说，本申请的试剂中，可以单独使用SeqIDNo.1和SeqIDNo.2所示序列的引物，也可以与探针一起使用，具体使用方式可以根据检测条件和环境选择。本申请的一种实现方式中，由于采用便携式的常温等温扩增荧光检测仪，优选的将引物和探针一起使用，通过荧光法对RPA扩增产物进行检测。优选的，荧光淬灭基团-dT为BHQ1-dT。优选的，碱基类似物为dSpacer。优选的，荧光基团-dT为6-FAM-dT。需要说明的是，根据探针的设计原则，只需要在碱基类似物的两端分别修饰荧光基团和荧光淬灭基团即可，本申请的优选方案中，优选的使用FAM荧光基团和BHQ1荧光淬灭基团。可以理解，荧光基团的选择是根据所使用的荧光检测仪的荧光通道进行的，不同的荧光检测仪具有检测一种或多种荧光基团的通道，例如FAM、TET、JOE、HEX、CY3、CY5等；而荧光淬灭基团则是根据荧光基团进行选择的，荧光淬灭基团的吸收光谱只要能够覆盖荧光基团的发射光谱即可，不只限于BHQ1。优选的，本申请的用于非洲猪瘟病毒检测的试剂还包括用于重组酶聚合酶扩增的反应液、酶和反应添加剂。需要说明的是，本申请的试剂，是特别针对非洲猪瘟病毒的重组酶聚合酶扩增检测设计的，因此，为了使用方便，试剂中完全可以进一步的包括用于重组酶聚合酶扩增的反应液、酶和反应添加剂。其中，反应液在本申请的一种实现方式中为RehydrationBuffer，酶可以是混合有多种酶的RPA冻干酶粉，反应添加剂在本申请的一种实现方式中采用的是MgAc。本申请的另一面公开了本申请的用于非洲猪瘟病毒检测的试剂在非洲猪瘟病毒检测中的应用。本申请的另一面公开了本申请的用于非洲猪瘟病毒检测的试剂在制备非洲猪瘟病毒检测试剂盒或设备中的应用。本申请的再一面公开了一种用于非洲猪瘟病毒检测的试剂盒，该试剂盒中含有本申请的用于非洲猪瘟病毒检测的试剂。本申请的再一面公开了一种非洲猪瘟病毒的检测方法，包括采用本申请的用于非洲猪瘟病毒检测的试剂，对待测样品的核酸进行重组酶聚合酶扩增检测，并采用荧光检测仪收集荧光。需要说明的是，本申请的检测方法，通过重组酶聚合酶扩增对非洲本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于非洲猪瘟病毒检测的试剂，其特征在于：所述试剂包括用于重组酶聚合酶扩增的非洲猪瘟病毒特异性引物对和探针，所述探针在引物对的扩增靶标区域内，所述引物对的上游引物为Seq ID No.1所示序列，下游引物为Seq ID No.2所示序列，所述探针为Seq ID No.3所示序列或者Seq ID No.3所示序列的反向互补序列；Seq ID No.1：5’‑TATTGTGAGAGTTCTCGGGAAAATGTTGTG‑3’Seq ID No.2：5’‑CATTCATGATTTGCACAAGCCGCACCAAAGC‑3’Seq ID No.3：5’‑GGAATTTCGGGTTGGTATGGCTGCACGTTCGCTGCGTATCATTTTCAT‑3’其中，SEQ ID No.3所示的探针序列中，第28个碱基修饰荧光淬灭基团‑dT，第31个碱基替换为碱基类似物，第33个碱基修饰荧光基团‑dT，3’末端修饰C3Spacer。

【技术特征摘要】
1.一种用于非洲猪瘟病毒检测的试剂，其特征在于：所述试剂包括用于重组酶聚合酶扩增的非洲猪瘟病毒特异性引物对和探针，所述探针在引物对的扩增靶标区域内，所述引物对的上游引物为SeqIDNo.1所示序列，下游引物为SeqIDNo.2所示序列，所述探针为SeqIDNo.3所示序列或者SeqIDNo.3所示序列的反向互补序列；SeqIDNo.1：5’-TATTGTGAGAGTTCTCGGGAAAATGTTGTG-3’SeqIDNo.2：5’-CATTCATGATTTGCACAAGCCGCACCAAAGC-3’SeqIDNo.3：5’-GGAATTTCGGGTTGGTATGGCTGCACGTTCGCTGCGTATCATTTTCAT-3’其中，SEQIDNo.3所示的探针序列中，第28个碱基修饰荧光淬灭基团-dT，第31个碱基替换为碱基类似物，第33个碱基修饰荧光基团-dT，3’末端修饰C3Spacer。2.根据权利要求1所述的用于非洲猪瘟病毒检测的试剂，其特征在于：所述荧光淬灭基团-dT为BHQ1-dT。3....

【专利技术属性】
技术研发人员：花群义，林彦星，花群俊，曾少灵，曹琛福，杨俊兴，
申请(专利权)人：深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：广东,44