PEDV免疫检测层析试纸条及其制备方法和应用技术

本申请公开一种PEDV免疫检测层析试纸条及其制备方法和应用。本申请的PEDV检测免疫层析试纸条，包括搭接在支撑材料上的样品垫和层析条；层析条上设置有检测线和质控线，检测线上固定有抗PEDV包被抗体，质控线上固定有羊抗鼠IgG抗体；样品垫上喷涂有量子点标记抗PEDV抗体探针。本申请的PEDV免疫检测层析试纸条，利用量子点标记抗PEDV抗体探针进行检测，充分结合荧光量子点高灵敏的特性，以及抗原抗体特异性结合的特点，使得本申请的免疫层析检测试纸条具有灵敏度高、特异性好，且检测周期短的优势，能够满足现场检测的需求，适合用于猪流行性腹泻病毒的普查监测。

【技术实现步骤摘要】
PEDV免疫检测层析试纸条及其制备方法和应用
本专利技术涉及免疫层析检测
，具体涉及一种PEDV免疫检测层析试纸条及其制备方法和应用。
技术介绍
猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种烈性猪传染病，是目前全球传播较广的一种猪的传染病，我国将其列为二类动物传染病。猪流行性腹泻在多个国家流行，并有愈演愈烈的趋势，对PEDV的快速诊断是防控PED流行的前提和基础，各国都加强了对流行性腹泻的监控。但传统的鉴别诊断方法，如病毒的抗原检测、病毒的免疫电镜观察、病毒的分离与鉴定等，都需要十分烦琐的病料前处理，不但工作量大、耗时长，而且操作复杂、诊断成本高。因此，建立一个操作简单、灵敏度高，特异性强、检测时间短的能够广泛运用的诊断方法显得尤为迫切。
技术实现思路
本申请的目的提供一种PEDV免疫检测层析试纸条及其制备方法和应用。为了实现上述目的，本申请采用了一下技术方案：本申请的一方面公开了一种PEDV免疫检测层析试纸条，其包括搭接在支撑材料上的样品垫和层析条；层析条上设置有检测线和质控线，检测线上固定有抗PEDV包被抗体，质控线上固定有羊抗鼠IgG抗体；样品垫上喷涂有量子点标记抗PEDV抗体探针。需要说明的是，本申请的关键在于将抗PEDV包被抗体固定在检测线上，并在样品垫上喷涂有量子点标记抗PEDV抗体探针；使用时，待测样品中如果含有PEDV，PEDV会与量子点标记抗PEDV抗体探针结合，然后层析到检测线时会被抗PEDV包被抗体捕获，从而在检测线位置处聚集；而没有结合PEDV的量子点标记抗PEDV抗体探针则会继续层析到质控线位置处被羊抗鼠IgG抗体捕获，在质控线上集聚；质控线和检测线捕获的量子点标记抗PEDV抗体探针，在365nm紫外光照射下会发出明亮的荧光条带，通过检测仪分析这些荧光信号即可实现PEDV的现场快速检测。可以理解，本申请的关键在于抗PEDV包被抗体和量子点标记抗PEDV抗体探针的使用，实现了PEDV的免疫层析试纸条检测，至于支撑材料、样品垫、层析条等材料可以参考现有的免疫层析试纸，在此不做具体限定；甚至抗体包被方法、抗体与量子点的结合方法、喷涂方法等都可以参考现有技术，在此不做具体限定。还需要说明的是，借助荧光量子点高灵敏的特性，结合抗原抗体特异性结合的特点，本申请的免疫层析抗原检测试纸条具有灵敏度高，特异性好，且检测周期短的优势，适合用于猪流行性腹泻病毒的分子生物学检测和大规模的流行病学调查。优选的，量子点标记抗PEDV抗体探针由PEDV单克隆抗体10A8a与羧基功能化量子点共价连接而成；抗PEDV包被抗体为PEDV单克隆抗体10F2a；其中，PEDV单克隆抗体10A8a、10F2a均为商品化购置针对PEDV的N蛋白单克隆抗体。需要说明的是，原则上只要将两个能够匹配的PEDV抗体分别作为本申请的PEDV荧光量子点免疫层析试纸条的抗PEDV包被抗体和量子点标记抗PEDV抗体即可实现本申请的免疫层析试纸条；但是，本申请的一种实现方式中，优选的，量子点标记抗PEDV抗体探针由PEDV单克隆抗体10A8a与羧基功能化量子点共价连接而成；抗PEDV包被抗体为PEDV单克隆抗体10F2a。PEDV单克隆抗体10A8a和PEDV单克隆抗体10F2a均为购置的商业化单克隆抗体。优选的，层析条为硝酸纤维素膜。优选的，样品垫为玻璃纤维垫。本申请的另一面公开了本申请的PEDV免疫检测层析试纸条在制备PEDV检测试剂盒或装置中的应用。本申请的再一面公开了本申请的PEDV免疫检测层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：量子点标记抗PEDV抗体探针制备，将羧基功能化的量子点与抗PEDV抗体共价连接，制成量子点标记抗PEDV抗体探针；样品垫制备，将玻璃纤维垫用含D-(+)海藻糖、1％BSA和0.1％Tween20的磷酸盐缓冲液浸泡，然后烘箱干燥，将制备的量子点标记抗PEDV抗体探针喷涂与干燥的玻璃纤维垫上，即获得样品垫；包被膜制备，将羊抗鼠IgG抗体喷涂在层析条的质控线位置，将抗PEDV包被抗体喷涂在检测线位置，将喷涂好的层析条烘干，即获得包被膜；免疫层析试纸条组装，将样品垫、层析条即包被膜按顺序搭接在支撑材料上，即获得PEDV荧光量子点免疫层析试纸条。优选的，量子点标记抗PEDV抗体探针制备中，抗PEDV抗体为PEDV单克隆抗体10A8a。优选的，免疫层析试纸条组装中，还包括对组装的试纸条进行裁剪。由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：本申请的PEDV免疫检测层析试纸条，利用量子点标记抗PEDV抗体探针进行检测，充分结合荧光量子点高灵敏的特性，以及抗原抗体特异性结合的特点，使得本申请的免疫层析检测试纸条具有灵敏度高、特异性好，且检测周期短的优势，能够满足现场检测的需求，适合用于猪流行性腹泻病毒的分子生物学检测和大规模的流行病学调查。附图说明图1为本申请实施例中PEDV免疫检测层析试纸条的检测荧光强度随反应时间的变化曲线图；图2为本申请实施例中PEDV免疫检测层析试纸条灵敏度试验结果图；图3为本申请实施例中PEDV免疫检测层析试纸条特异性试验结果。具体实施方式实时荧光RT-PCR具有高灵敏度、高特异性、快速的特点，被国内外广泛应运于人医的临床检测和兽医的临床诊断，并且很多病毒的荧光PCR检测方法都被列为了检测标准，在猪流行性腹泻方面也有相关研究，但一直未能获得可以快速、灵敏，满足现场荧光检测的检测猪流行性腹泻病毒的产品。本申请的专利技术人在长期的科学研究发现，结合荧光量子点高灵敏的特性，以及抗原抗体特异性结合的特点，采用羧基功能化量子点与抗PEDV抗体通过酰胺键共价结合，获得抗PEDV抗体与PEDV结合荧光显色的条件，从而获得本申请具有灵敏性高、特异性好、检测周期短的免疫层析抗原检测试纸条，满足现场检测的需求，适合用于猪流行性腹泻病毒的分子生物学检测和大规模的流行病学调查。下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。实施例一、材料和设备(1)细胞及病毒Vero-76传代细胞系、猴肾传代细胞系(MA-104)、猪源肾脏细胞(PK-15)、SP2/0-Ag14(简称SP2)骨髓瘤细胞，均由华南农业大学兽医学院微生物学与免疫学教研室提供核保存。2015-PEDV-6、2016-PEDV+PRoVA-1、2016-PEDV+PRoVA-2、2016-PRoVA-1、2017-PEDV+PRoVA+TGEV-3、TGEV-GD均由华南农业大学兽医学院微生物学与免疫学教研室提供核保存。“科泻宁”，猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗(WH-1株+AJ1102株)为武汉科前生物股份有限公司产品；猪病毒性腹泻三联活疫苗，猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒(G5型)三联活疫苗(弱毒华毒株+弱毒CV777株+NX株)，为哈尔滨维科生物技术开发有限公司产品。(2)主要试剂细胞基础培养基DMEM和1640、GIBCO胎牛血清FBS为ThermoFisher公司产品；PVDF膜(0.2μm/0.45μm)为Milipore公司产品；NAbTMSpinKitsforAntibodyPurification；ISOSTRIPMOUSEMAB本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种PEDV免疫检测层析试纸条，其特征在于：包括搭接在支撑材料上的样品垫和层析条；所述层析条上设置有检测线和质控线，所述检测线上固定有抗PEDV包被抗体，所述质控线上固定有羊抗鼠IgG抗体；所述样品垫上喷涂有量子点标记抗PEDV抗体探针。

【技术特征摘要】
1.一种PEDV免疫检测层析试纸条，其特征在于：包括搭接在支撑材料上的样品垫和层析条；所述层析条上设置有检测线和质控线，所述检测线上固定有抗PEDV包被抗体，所述质控线上固定有羊抗鼠IgG抗体；所述样品垫上喷涂有量子点标记抗PEDV抗体探针。2.根据权利要求1所述的PEDV免疫检测层析试纸条，其特征在于：所述量子点标记抗PEDV抗体探针由PEDV单克隆抗体10A8a与羧基功能化量子点共价连接而成；所述抗PEDV包被抗体为PEDV单克隆抗体10F2a；所述PEDV单克隆抗体10A8a、10F2a均为针对PEDV的N蛋白的单克隆抗体。3.根据权利要求1或2所述的PEDV免疫检测层析试纸条，其特征在于：所述层析条为硝酸纤维素膜。4.根据权利要求1或2所述的PEDV免疫检测层析试纸条，其特征在于：所述样品垫为玻璃纤维垫。5.根据权利要求1-4任一项所述的PEDV免疫检测层析试纸条在制备PEDV检测试剂盒或装置中的应用。6.根据权利要求1-4任...

【专利技术属性】
技术研发人员：李军，李汉锐，秦智锋，孙洁，郑晓聪，陈兵，刘建利，王津津，于力，
申请(专利权)人：深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，华南农业大学，清华大学深圳研究生院，
类型：发明
国别省市：广东,44