一种引物组合物及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种引物组合物及其应用，所述引物组合物包括上游引物、下游引物和测序引物，其中，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；通过选取SLC30A8基因启动子特定区域的6个CpG位点，亚硫酸氢盐处理基因组DNA，以处理后的产物为模板，对SLC30A8基因启动子特定区域进行扩增并采用焦磷酸测序检测该6个位点的甲基化比例，优化实验条件参数，各步骤各条件相互配合，准确定性检测位点变化情况和频率变化，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

A Primer Composition and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种引物组合物及其应用
本专利技术属于生物
，涉及一种引物组合物及其应用。
技术介绍
糖尿病(diabetesmellitus，DM)是一种遗传与环境因素综合作用导致的慢性代谢性疾病，主要是由于胰岛素分泌不足及功能障碍导致的机体糖代谢异常，并引发蛋白质、脂肪、电解质和水盐的代谢紊乱，慢性高血糖是其诱发因素和主要特征。随着我国经济发展、人口老龄化和城镇化进程的加速，糖尿病等慢性非传染性代谢疾病的发病率将会明显增加，2010年中国慢性病及其危险因素监测报告显示，我国18岁及以上成人的糖尿病患病率达11.6％，2013年为10.7％，由此推测我国成年糖尿病患者人数为1.14亿，已成为世界上糖尿病患者人数最多的国家。其中2型糖尿病(type2diabetesmellitus，T2DM)为绝大多数，占糖尿病患者90％以上。T2DM是胰岛素抵抗(IR)和胰岛β细胞功能缺陷共同导致的体内胰岛素作用不足，从而引发一系列代谢异常，是由多个基因遗传因素及环境因素综合引起的复杂病，因此，遗传因素在T2DM的产生和发展过程中起到至关重要的作用。SLC30A8是新近发现的T2DM相关易感基因。该基因定位于人类第8号染色体的8q24.11，它编码与人类胰岛素分泌有关的锌转运载体蛋白8(ZNT-8)。该蛋白在β细胞囊泡膜上主要负责锌离子的聚集，为胰岛素的合成及储存提供锌离子，因此，其数量与活性的改变都将影响锌离子的聚集，从而在胰岛素的合成、储存及分泌过程中发挥举足轻重的作用。近几年来，表观遗传学与疾病的发生发展的相关性已逐渐成为生物医学研究的焦点。与人类疾病相关的表观遗传学有DNA甲基化、mRNA的调控表达、基因印记以及组蛋白修饰等。DNA甲基化作为一种重要的表观遗传修饰方式，在T2DM患者体内DNA甲基化改变引起T2DM相关基因的表达异常，而相关基因的表达异常可能在疾病的发生及发展进程中起着非常重要的作用。同时，环境因素通过影响DNA甲基化修饰，也会增加T2DM的发病风险。有研究显示，SLC30A8基因启动子区域甲基化可能导致基因mRNA表达下降，从而对T2DM的发生发展有着重要影响。而环境因素中，肥胖、吸烟、精神压力和睡眠低氧对该基因启动子区的甲基化有影响，这些因素可能通过调控该基因的甲基化影响T2DM的发病风险。因此，针对SLC30A8基因启动子区域提供一种引物组合物，检测该基因启动子区域的甲基化状态，有助于辅助预测T2DM发病的危险性，从而能及早发现高危人群、并进行更早期的干预。
技术实现思路
针对现有技术的不足及实际的需求，本专利技术提供一种引物组合物及其应用，通过选取SLC30A8基因启动子特定区域的6个CpG位点，亚硫酸氢盐处理基因组DNA，以处理后的产物为模板，对SLC30A8基因启动子特定区域进行扩增并采用焦磷酸测序检测该6个位点的甲基化比例，优化实验条件参数，各步骤各条件相互配合，准确定性检测位点变化情况和频率变化，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种引物组合物，所述引物组合物包括上游引物、下游引物和测序引物，其中，所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述测序引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。其中，所述上游引物的序列SEQIDNO.1如下：TGGTTAGTTTAGAGAGGGGTTTT.所述下游引物的序列SEQIDNO.2如下：ACCTTCCTTCAATATACATTAACTAATCT.所述测序引物的序列SEQIDNO.3如下：AGAGAGGGGTTTTTAG.优选地，所述引物组合物的模板为核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的SLC30A8基因启动子特定区域。所述SEQIDNO.4的序列如下：CGGGCTGAAGGGCTTCTCGAGCATGCCCAGAGCGGACGCCGAGGCCG.优选地，所述下游引物的5’端被生物素标记。本专利技术中，专利技术人在长期的科研实践过程中，通过检测该基因的甲基化情况，研究SLC30A8基因对T2DM发生发展的影响，通过选取SLC30A8基因启动子特定区域的6个CpG位点，设计上下游引物和测序引物，亚硫酸氢盐处理基因组DNA，以处理后的产物为模板，对SLC30A8基因启动子特定区域进行扩增并采用焦磷酸测序检测该6个位点的甲基化比例，以引物和模板为基础，优化实验条件参数，各步骤各条件相互配合，准确定性检测位点变化情况和频率变化，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。第二方面，本专利技术提供一种如第一方面所述的引物组合物用于制备检测SLC30A8基因启动子区域甲基化的试剂盒的应用。第三方面，本专利技术提供一种检测SLC30A8基因启动子区域甲基化的方法，所述采用如第一方面所述的引物组合物。优选地，所述方法包括如下步骤：(1)根据核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的SLC30A8基因启动子特定区域设计引物，得到如第一方面所述的引物组合物；(2)对基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理，将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，得到处理后的产物；(3)以步骤(2)处理后的产物为模板，采用步骤(1)得到的上下游引物，对SLC30A8启动子特定区域进行PCR扩增，得到扩增后产物；(4)采用步骤(1)得到的测序引物，以步骤(3)扩增后产物为模板进行测序，检测SLC30A8启动子特定区域的6个CpG位点的甲基化比例，并进行数据分析。优选地，步骤(2)所述处理的试剂盒包括EpitectFastDNABisulfiteKit。其中，步骤(2)使用EpitectFastDNABisulfiteKit(QIAGEN，Cat:59824or59826)对基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理，使所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。其中，步骤(3)使用PyroMarkPCRKit(QIAGEN，Cat:978703)及上下游引物对SLC30A8启动子特定区域进行PCR扩增。优选地，步骤(3)所述扩增的体系见表1；表1扩增体系优选地，步骤(3)所述扩增的条件见表2；表2扩增条件优选地，步骤(4)所述测序的平台包括QIAGENPyroMarkQ24焦磷酸测序平台；焦磷酸测序可在一次检测中快速定量一个或多个甲基化位点，是目前最理想的验证方法；因此该技术在表观遗传学研究中逐渐成为数据分析的金标准。其中，步骤(4)所述测序在QIAGENPyroMarkQ24焦磷酸测序平台，使用测序引物，以扩增产物为模板，检测SLC30A8启动子区域6个CpG位点的甲基化比例；所使用的试剂为PyroMarkGoldQ24Reagents(QIAGEN，Cat:970802)，PyroMarkBindingBuffer(QIAGEN，Cat:979006)，PyroMarkAnnealingBuffer(QIAGEN，Cat:979009)，PyroMarkDenaturationSol.(QIAGEN，Cat:979007)，PyroMarkWashBuffer(QIAGEN，Cat:979008)，StreptavidinSepharose(r)HighPerformanceBeads(GE，Cat:17-51本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括上游引物、下游引物和测序引物，其中，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

【技术特征摘要】
1.一种引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括上游引物、下游引物和测序引物，其中，所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述测序引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。2.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物的模板为核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的SLC30A8基因启动子特定区域。3.根据权利要求1或2所述的引物组合物，其特征在于，所述下游引物的5’端被生物素标记。4.一种如权利要求1-3中任一项所述的引物组合物用于制备检测SLC30A8基因启动子区域甲基化的试剂盒的应用。5.一种检测SLC30A8基因启动子区域甲基化的方法，其特征在于，所述采用如权利要求1或2所述的引物组合物。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)根据核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的SLC30A8基因启动子特定区域设计引物，得到如权利要求1所述的引物组合物；(2)对基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理，将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，得到处理后的产物；(3)以步骤(2)处理后的产物为模板，采用步骤(1)得到的上下游引物，对SLC30A8启动子特定区域进行PCR扩增，得到扩增后产物；(4)采用步骤(1)得到的测序引物，以步骤(3)扩增后产物为模板进行测序，检测SLC30A8启动子特定区域的6个CpG位点的甲基化比例，并进行数据分析。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述处理的试剂盒包括EpitectFastDNAB...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈佳骊，朱爱思，张亚飞，
申请(专利权)人：凯杰苏州转化医学研究有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32