一种基于核糖体结合位点改造的启动子优化方法技术

一种基于核糖体结合位点改造的启动子优化方法，S1、具体为将枯草芽胞杆菌中P43启动子的转录起始位点后的核糖体结合位点的序列扩增；S2、再通过引物设计，扩增出带核糖体结合位点序列的P43启动子，以获得具有至少一种结构功能的序列。其优点是：将P43启动子中核糖体结合位点进行本发明专利技术的优化方法，使得优化后的启动子与mRNA的结合水平提高，继而提高了目的基因的表达水平。

Promoter optimization method based on ribosome binding site modification

An optimization method of ribosome binding site transformation promoter based on S1, for specific transcription initiation site of P43 promoter in Bacillus subtilis after the ribosome binding site sequence amplification; S2, amplified by primer design, binding site sequence of P43 promoter sequence with the ribosome, for having at least one the structure and function of. The invention has the advantages that the ribosome binding site of the P43 promoter is optimized by the method, so that the binding level of the optimized promoter and the mRNA is improved, and the expression level of the target gene is improved.

【技术实现步骤摘要】
一种基于核糖体结合位点改造的启动子优化方法
本专利技术涉及基因工程和微生物工程
，具体地说是一种基于核糖体结合位点改造的启动子优化方法。
技术介绍
启动子是一段位于结构基因5’端上游区的DNA序列，是DNA分子上被RNA聚合酶和转录调节因子等识别并结合形成转录起始复合物的区域。启动子的保守结构特征有：-10区、-35区、两个区之间的间隔距离和转录起始位点TSS。两个识别区之间的序列虽然并不保守，但是其间隔距离的保守性对于RNA聚合酶结合时的空间几何构象十分重要。之前研究结果表明，启动子-10位的TATA区和-35位的TTGACA区是RNA聚合酶与启动子的结合位点，能与σ因子相互识别而具有很高的亲和力。原核生物中-10区同-35区之间核苷酸数目的变动会影响基因转录活性的高低，强启动子一般为17±1bp，当间距小于15bp或大于20bp时都会降低启动子的活性。同时，-35区共有序列5’-TTGACA-3’跟-10区共有序列5’-TATAAT-3’高度保守，对于大多数启动子来说，-10区与-35区的序列与共有序列的相似程度越高，其启动子的转录强度越高。启动子上与RNA聚合酶核心酶和σ因子互作的功能区域包括-35区、-10区、扩展的-10区(extended-10)、上游增强元件(UPelement)和+1区的转录起始位点，一些启动子还存在着与激活蛋白与阻遏蛋白结合的位点。不同启动子表现出的转录效率高低，归根结底在于功能结构序列的不同，如何通过对上述结构的缺失、添加和突变，以得到适用于生产应用和理论研究的理想启动子，使目前亟待解决的问题。mRNA是生物信息传递链中的重要一环，与蛋白质翻译密切相关，有效的翻译起始决定蛋白质能否顺利进行翻译(Gold1988)。mRNA的5’端非编码区存在着一个重要的功能元件：核糖体结合位点RBS，也即原核生物中的SD序列。原核生物翻译需要核糖体与核糖体结合位点和起始密码子同时结合，核糖体的16S序列与RBS互补配对，起始转运RNA(tRNA)与起始密码子结合，从而开始翻译蛋白。研究表明mRNA的5’端形成的二级结构对于翻译起始会产生重要影响，如果SD序列和起始密码子位于较稳定的发夹结构中，那么核糖体识别难度会大幅增加，导致翻译起始效率降低，蛋白表达水平下降。
技术实现思路
为了解决上述技术缺陷，本专利技术提供一种用于提高产量的启动子及其制备方法，以增强核糖体识别能力，提高翻译起始效率和外源蛋白表达水平。本专利技术一方面，提供一种基于核糖体结合位点改造的启动子优化方法，S1、具体为将枯草芽胞杆菌中P43启动子的转录起始位点后的核糖体结合位点的序列扩增；S2、再通过引物设计，扩增出带核糖体结合位点序列的P43启动子，以获得具有至少一种结构功能的序列。本专利技术第二方面，保护一种通过上述方法获得的启动子。本专利技术第三方木，保护一种含第二方面所述启动子的载体。一种基于核糖体结合位点改造的启动子优化方法，其优点是：将P43启动子中核糖体结合位点进行本专利技术的优化方法，使得优化后的启动子与mRNA的结合水平提高，继而提高了目的基因的表达水平。附图说明图1A、1B为启动子P43转录产物5’端非翻译区二级结构图示其中图1A是根据文献报导，启动子P43转录出的序列推测在5’端会形成的一个发夹结构(Wangetal1984)；图1B为Mfold软件推定的结构；图2为扩增纳豆激酶载体中表达元件pRBS5NK的琼脂糖凝胶图；其中，泳道1为来源于枯草芽胞杆菌168中启动子P43经改造过后RBS5的条带(284bp)；泳道2为以对照菌质粒pP43SacCNK为模板扩增出来的纳豆激酶基因条带SacCNK(1629bp)；泳道3为启动子RBS5和纳豆激酶片段SacCNK做SOE-PCR连接的条带RBS5NK(1913bp)，泳道M为5KDNAmarker；此图证明了纳豆激酶载体中表达元件的扩增均成功；图3为重组载体转化地衣芽胞杆菌BL10菌落PCR验证图；其中，泳道1-5为用引物pHY-F/pHY-R进行不同转化子的菌落PCR验证时条带(2184bp)，泳道M为5Kmarker；图4为对照菌株地衣芽胞杆菌BL10(pP43SacCNK)和启动子优化后的菌株发酵终点的SDS-PAGE图；其中，泳道M为Proteinmolecularweightmarker，泳道1为对照菌BL10(pP43SacCNK)的胞外总蛋白浓缩10倍后的发酵上清液样，泳道2～6分别为改造菌BL10(pRBS1NK)，BL10(pRBS2NK)，BL10(pRBS3NK)，BL10(pRBS4NK)，BL10(pRBS5NK)的胞外总蛋白浓缩10倍后的发酵上清液样。具体实施方式本专利技术一方面，提供一种基于核糖体结合位点改造的启动子优化方法，S1、具体为将枯草芽胞杆菌中P43启动子的转录起始位点后的核糖体结合位点的序列扩增；S2、再通过引物设计，扩增出带核糖体结合位点序列的P43启动子，以获得具有至少一种结构功能的序列。优选地，对所述核糖体结合位点的序列进行优化的方法为：S1、根据NCBI数据库发布的B.subtilis168基因组序列NZ_CP010052.1，找到P43原始序列，具体序列见序列表SEQIDNO:1；利用PrimerPrimier5软件设计引物P43-F和P43-SOE-R，以B.subtilis168总DNA为模板扩增出原始启动子P43；S2、将步骤S1扩增出的启动子P43作为模板，利用PrimerPrimier5软件设计引物P43-F和P43RBS1-SOE-R，且在设计方向引物时，引物P43RBS1-SOE-R后面5个碱基减掉，并在引物P43RBS1-SOE-R的前面添加TTCAT这5个碱基，通过PCR扩增出启动子RBS1，使得扩增出来的序列后面多出序列ATGAA，其具体序列见序列表SEQIDNO:2。或者优选地，对所述核糖体结合位点的序列进行优化的方法为：S1、根据NCBI数据库发布的B.subtilis168基因组序列NZ_CP010052.1，找到P43原始序列，具体序列见序列表SEQIDNO:1；利用PrimerPrimier5软件设计引物P43-F和P43-SOE-R，以B.subtilis168总DNA为模板扩增出原始启动子P43；S2、以步骤S1扩增出的启动子P43为模板，利用PrimerPrimier5软件设计引物P43-F和P43RBS2-SOE-R，将两个碱基C和A从P43颈环结构上去除，并且将RBS结合区由GTAAGAGAGG变为GAAAGGAGG，通过PCR扩增出启动子RBS2，其具体序列见序列表SEQIDNO:3。或者优选地，对所述核糖体结合位点的序列进行优化的方法为：S1、根据NCBI数据库发布的B.subtilis168基因组序列NZ_CP010052.1，找到P43原始序列，具体序列见序列表SEQIDNO:1；利用PrimerPrimier5软件设计引物P43-F和P43-SOE-R，以B.subtilis168总DNA为模板扩增出原始启动子P43；S2、以步骤S1扩增出的启动子P43为模板，利用PrimerPrimier5软件设计引物P43-F和P43RBS2-SOE-R，将两个碱基C和A本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于核糖体结合位点改造的启动子优化方法，其特征在于：S1、具体为将枯草芽胞杆菌中P43启动子的转录起始位点后的核糖体结合位点的序列扩增；S2、再通过引物设计，扩增出带核糖体结合位点序列的P43启动子，以获得具有至少一种结构功能的序列。

【技术特征摘要】
1.一种基于核糖体结合位点改造的启动子优化方法，其特征在于：S1、具体为将枯草芽胞杆菌中P43启动子的转录起始位点后的核糖体结合位点的序列扩增；S2、再通过引物设计，扩增出带核糖体结合位点序列的P43启动子，以获得具有至少一种结构功能的序列。2.根据权利要求1所述一种基于核糖体结合位点改造的启动子优化方法，其特征在于：S1、根据B.subtilis168基因组序列NZ_CP010052.1，找到P43原始序列，具体序列见序列表SEQIDNO:1；设计引物P43-F和P43-SOE-R，以B.subtilis168总DNA为模板扩增出原始启动子P43；S2、将步骤S1扩增出的启动子P43作为模板，设计引物P43-F和P43RBS1-SOE-R，且在设计方向引物时，引物P43RBS1-SOE-R后面5个碱基减掉，并在引物P43RBS1-SOE-R的前面添加TTCAT这5个碱基，通过PCR扩增出启动子RBS1，使得扩增出来的序列后面多出序列ATGAA，其具体序列见序列表SEQIDNO:2。3.根据权利要求1所述一种基于核糖体结合位点改造的启动子优化方法，其特征在于：S1、根据B.subtilis168基因组序列NZ_CP010052.1，找到P43原始序列，具体序列见序列表SEQIDNO:1；设计引物P43-F和P43-SOE-R，以B.subtilis168总DNA为模板扩增出原始启动子P43；S2、以步骤S1扩增出的启动子P43为模板，设计引物P43-F和P43RBS2-SOE-R，将两个碱基C和A从P43颈环结构上去除，并且将RBS结合区由GTAAGAGAGG变为GAAAGGAGG，通过PCR扩增出启动子RBS2，其具体序列见序列表SEQIDNO:3。4.根据权利要求1所述一种基于核糖体结合位点改造的启动子优化方法，其特征在于：S1、根据B.subtilis168基因组序列NZ_CP010052.1，找到P43原始序列，具体序列见序列表SEQIDNO:1；设计引物P43-F和P43-SOE-R，以B.subtilis168总DNA为模板扩增出原始启动子P43；S2、以步骤S1扩增出的启动子P43为模板，设计引物P43-F和P43RBS2-SOE-R，将两个碱基C和A从P43颈环结构上去除，并且将RBS结合区由GTAAGAGAGG变为GAAAG...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈守文，彭炳，何鹏辉，蔡冬波，陈耀中，王勤，魏雪团，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42