分子检测小菜蛾对多杀霉素抗性的方法及引物对技术

本发明专利技术公开了一种快速鉴定小菜蛾烟碱型乙酰胆碱受体基因突变的方法及其专用引物。通过检测烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基基因第十二号外显子区域是否发生9个碱基的缺失突变从而判定待测小菜蛾对多杀霉素的抗性，发生了所述的9个碱基的缺失突变的小菜蛾具有对多杀霉素抗性，未发生所述的9个碱基的缺失突变的小菜蛾不具备对多杀霉素抗性。该方法具有快速简便、准确性高的优点，可用于监测小菜蛾田间种群对多杀霉素的抗性等位基因频率和抗药性发生发展动态，为制订小菜蛾化学治理方案提供重要依据，为延缓多杀霉素类杀虫剂抗性发展具有重要意义。

Molecular detection methods and primer pairs for diamondback moth resistance

The invention discloses a method for rapid identification of diamondback moth nicotinic acetylcholine receptor gene mutation and its special primer. Through the detection of the nicotinic acetylcholine receptor alpha 6 subunit gene exon twelfth deletion is 9 base region mutations to determine the diamondback moth tested resistance to spinosad, deletion occurred in 9 of the mutation of the diamondback moth of spinosad resistance, 9 deletion did not occur the mutation of the diamondback moth does not have on the spinosad resistance. This method has the advantages of simple, fast and high accuracy, can be used for monitoring the diamondback moth field populations of spinosad resistance allele frequency and resistance development, provide an important basis for the formulation of the diamondback moth chemical treatment plan, has important significance for delaying spinosad insecticide resistance development.

【技术实现步骤摘要】
分子检测小菜蛾对多杀霉素抗性的方法及引物对
本专利技术属于生物
，涉及分子检测小菜蛾对多杀霉素抗性的方法及引物对。技术背景小菜蛾(Plutellaxylostella)属于鳞翅目菜蛾科，英文名Diamondbackmoth，是世界性十字花科蔬菜和油菜害虫，全球每年造成的损失和防治费用高达四五十亿美元。20世纪80年代中后期以来，小菜蛾在我国持续大面积暴发成灾，尤其以华南和西南省份为害严重。据统计，近年来我国蔬菜种植面积接近3亿亩/年，已是世界第一大蔬菜种植和生产国，因小菜蛾为害造成的蔬菜减产和治理费用极其高昂。目前，农业生产上对小菜蛾的防治仍以化学农药为主，由于杀虫药剂的不合理使用及小菜蛾本身的生物学特性，导致其对几乎所有常用杀虫剂均产生了抗性。我国田间小菜蛾种群的抗药性发展速度极快，并导致蔬菜农药残留超标严重威胁农产品质量安全，小菜蛾抗药性治理形势不容乐观。多杀霉素类化合物(spinosyns)是美国陶氏益农公司在20世纪90年代初期开发的一类天然杀虫产品，属大环内酯类化合物，由土壤放线菌刺糖多孢菌SaccharopolysporaspinosaMertz&Yao在培养介质中经有氧发酵而得的次级代谢产物，包括20多种活性组分。第一代商业化spinosyns产品多杀霉素(spinosad)首先在美国登记用于作物害虫防治，由spinosynsA(主要成分)和spinosynsD(次要成分)两种化合物混合而成，有很高的生物活性，而且对非靶标生物的毒性很低，对人和其它哺乳动物非常安全。但是，除小菜蛾外，目前已报道包括烟芽夜蛾、家蝇、甜菜夜蛾、果蝇、美洲菊斑潜蝇、棉铃虫和西花蓟马等多个目的田间采集种群和室内选育品系对该药剂产生了较为严重的抗药性。从现有研究报道来看，只有小部分研究结论表明昆虫对多杀霉素抗性可能与代谢相关，多数研究结果支持靶标抗性机理。Perry等(2007)利用基因敲除技术沉默了果蝇的nAChRDα6亚基，发现该基因的功能缺失致使果蝇对多杀霉素产生1181倍的抗性，推测在其它物种中nAChRα6的基因突变可能会导致对多杀霉素的抗性。Baxter等(2010)在对多杀霉素极高抗品系(抗性约18,600倍)的研究中取得进展，发现抗多杀霉素小菜蛾nAChRPxα6亚基存在错误剪接，使该基因在翻译过程中发生提前终止，导致第三跨膜区之后的蛋白缺失。家蝇抗多杀霉素的研究也显示是基于靶标的抗性机理，但通过比较家蝇的nAChRMdα6亚基抗性和敏感品系该基因选择性剪接、mRNA表达水平及RNA编辑等转录后调控因子，表明nAChRMdα6基因在家蝇对多杀霉素的抗性形成中未起作用(Gao等，2007a)。并且Mdα5和Mdβ3也没有发现与抗性相关的基因突变(Gao等，2007b)。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中小菜蛾对杀虫剂多杀霉素抗性检测方法灵敏度低、周期长、材料要求高等问题，根据我们对小菜蛾抗多杀霉素的分子机理的研究结果，提供一种分子检测小菜蛾对多杀霉素抗性的方法及引物对。本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基TM4缺失突变作为靶标在分子检测小菜蛾对多杀霉素抗性中的应用；所述的烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基TM4缺失突变是指烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基基因第十二号外显子区域发生9个碱基的缺失突变，导致其编码蛋白的第四跨膜结构域由FCLFVFTLFTIIATVAVLL组成的19个氨基酸突变为由FCLFVFTLFTTVAVLL组成的16个氨基酸；小菜蛾多杀霉素敏感品系烟碱型乙酰胆碱受体α6第四跨膜区TM4为FCLFVFTLFTIIATVAVLL组成的19个氨基酸构成的疏水结构域；多杀霉素抗性品系烟碱型乙酰胆碱受体α6第四跨膜区TM4为FCLFVFTLFTTVAVLL组成的16个氨基酸。其中涉及的小菜蛾烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基基因cDNA序列来自GenBank(GU207835andGQ247883)。分子检测小菜蛾对多杀霉素抗性的方法，通过检测烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基基因第十二号外显子区域是否发生9个碱基的缺失突变从而判定待测小菜蛾对多杀霉素的抗性，发生了所述的9个碱基的缺失突变的小菜蛾具有对多杀霉素抗性，未发生所述的9个碱基的缺失突变的小菜蛾不具备对多杀霉素抗性；烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基基因第十二号外显子区域发生9个碱基的缺失突变导致其编码蛋白的第四跨膜结构域由FCLFVFTLFTIIATVAVLL组成的19个氨基酸突变为由FCLFVFTLFTTVAVLL组成的16个氨基酸。本专利技术所述的方法，优选包括用SEQIDNO.1所示的特异性正向引物F和SEQIDNO.2所示的特异性反向引物R(5’端由FAM进行荧光标记)对烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基基因进行PCR扩增，通过对PCR产物进行毛细管电泳，根据毛细管电泳图谱直接鉴定小菜蛾个体α6亚基TM4跨膜区的编码基因是否存在由9bp的碱基缺失导致的IIA氨基酸的缺失突变及其具体类型，一次性区分该个体为对多杀霉素的敏感纯合子、抗性杂合子和抗性纯合子。所述的根据PCR产物的毛细管电泳图谱快速鉴定烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基是否发生TM4缺失突变及其具体类型，一次性区分出两个位点敏感纯合子、抗性杂合子和抗性纯合子的方法为：利用上述专用引物对扩增小菜蛾烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基，若PCR产物经毛细管电泳后显示为1个112bp的单峰，则检测的小菜蛾个体为多杀霉素敏感型纯合子(图2A)；若PCR产物经毛细管电泳后显示为1个112bp和1个103bp的双峰，则检测的小菜蛾个体为多杀霉素抗性杂合子(图2B)；若PCR产物经毛细管电泳后显示为1个103bp的单峰，则检测的小菜蛾个体为多杀霉素抗性型纯合子(图2C)。所述的分子检测方法，优选包含以下步骤：(1)提取单头小菜蛾幼虫或成虫的基因组DNA；(2)利用SEQIDNO.1所示的特异性正向引物F和SEQIDNO.2所示的特异性反向引物R，对上一步提取的小菜蛾基因组DNA进行PCR扩增；(3)将上一步获得的PCR产物进行毛细管电泳，通过毛细管电泳图谱检测烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基TM4跨膜区碱基缺失情况，一次性区分检测小菜蛾个体是否为烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基第四跨膜结构域缺失3个氨基酸的多杀霉素抗性个体。其中PCR反应体系25ul：12.5ul2xGCBufferI，1.25ULATaqDNA聚合酶,1ul单头小菜蛾样本的基因组DNA，1ul10mMdNTPs，10mM的引物各1ul，加双蒸水至反应总体积为25ul；PCR反应程序：94℃预变性3min，然后循环数为35：94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s。用于分子检测小菜蛾对多杀霉素抗性的引物对，由SEQIDNO.1所示的特异性正向引物F和SEQIDNO.2所示的特异性反向引物R组成。一种用于快速鉴定小菜蛾对多杀霉素抗性的试剂盒，包含本专利技术所述的引物对。本专利技术所述的引物对在制备分子检测小菜蛾对多杀霉素抗性中的应用。本专利技术所述的引物对在分子检测小菜蛾对多杀霉素抗性中的应用。本专利技术所述的试剂盒在分子检测小菜蛾对多杀霉素抗性中的应用。有益效果专利技术人研究发现小菜蛾烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基TM4跨膜结构域缺失IIA氨基本文档来自技高网...

【技术保护点】
烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基TM4缺失突变作为靶标在分子检测小菜蛾对多杀霉素抗性中的应用；所述的烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基TM4缺失突变是指烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基基因第十二号外显子区域发生9个碱基的缺失突变，导致其编码蛋白的第四跨膜结构域由FCLFVFTLFTIIATVAVLL组成的19个氨基酸突变为由FCLFVFTLFTTVAVLL组成的16个氨基酸；小菜蛾多杀霉素敏感品系烟碱型乙酰胆碱受体α6第四跨膜区TM4为FCLFVFTLFTIIATVAVLL组成的19个氨基酸构成的疏水结构域；多杀霉素抗性品系烟碱型乙酰胆碱受体α6第四跨膜区TM4为FCLFVFTLFTTVAVLL组成的16个氨基酸。

【技术特征摘要】
1.烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基TM4缺失突变作为靶标在分子检测小菜蛾对多杀霉素抗性中的应用；所述的烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基TM4缺失突变是指烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基基因第十二号外显子区域发生9个碱基的缺失突变，导致其编码蛋白的第四跨膜结构域由FCLFVFTLFTIIATVAVLL组成的19个氨基酸突变为由FCLFVFTLFTTVAVLL组成的16个氨基酸；小菜蛾多杀霉素敏感品系烟碱型乙酰胆碱受体α6第四跨膜区TM4为FCLFVFTLFTIIATVAVLL组成的19个氨基酸构成的疏水结构域；多杀霉素抗性品系烟碱型乙酰胆碱受体α6第四跨膜区TM4为FCLFVFTLFTTVAVLL组成的16个氨基酸。2.分子检测小菜蛾对多杀霉素抗性的方法，其特征在于通过检测烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基基因第十二号外显子区域是否发生9个碱基的缺失突变从而判定待测小菜蛾对多杀霉素的抗性，发生了所述的9个碱基的缺失突变的小菜蛾具有对多杀霉素抗性，未发生所述的9个碱基的缺失突变的小菜蛾不具备对多杀霉素抗性；烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基基因第十二号外显子区域发生9个碱基的缺失突变导致其编码蛋白的第四跨膜结构域由FCLFVFTLFTIIATVAVLL组成的19个氨基酸突变为由FCLFVFTLFTTVAVLL组成的16个氨基酸。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于包括用SEQIDNO.1所示的特异性正向引物F和SEQIDNO.2所示的特异性反向引物R对烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基基因进行PCR扩增，通过对PCR产物进行毛细管电泳，根据毛细管电泳图谱直接鉴定小菜蛾个体α6亚基TM4跨膜区的编码基因是否存在由9bp的碱基缺失导致的IIA氨基酸的缺失突变及其具体类型，一次性区分该个体为对多杀霉素的敏...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴益东，王兴亮，王敬，杨亦桦，武淑文，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32