检测VKORC1基因分型的引物探针组及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种检测VKORC1基因分型的引物探针组。所述引物探针组包括VKORC1野生型和突变型的通用下游引物和探针、野生型上游引物、突变型上游引物、内控GAPDH上游引物、下游引物及探针。本发明专利技术还涉及一种检测VKORC1基因分型的试剂盒。所述试剂盒包括PCR反应液1、PCR反应液2、阳性对照品及空白对照品。本发明专利技术提供的所述试剂盒具有灵敏度高，可达万分之一，最低检测限仅为1‑2拷贝，特别适合于低含量突变样本(如血清或血浆)的检测；与测序法相比，本发明专利技术的结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了PCR产物污染的风险，检测速度快，适用于高通量的样本检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及体外核酸检测
，尤其涉及一种检测VKORC1基因分型的引物探针组及试剂盒。
技术介绍
华法林是一种双香豆素衍生物，是目前临床上应用最广泛的口服抗凝药物之一，用于预防和治疗深静脉血栓、肺栓塞、心脏瓣膜置换术及房颤导致的血栓形成。华法林治疗窗较窄，很小的剂量都可能导致不良反应的发生，且在不同个体达到相同作用效果，高低剂量者之间可相差10倍以上。维生素K环氧化物还原酶复合体1(Vitaminkepoxidereductasesubunit1，VKORC1)是维生素K循环中的关键酶，华法林因抑制该酶而阻断维生素K以辅因子形式参与羧化酶的催化反应，抑制了凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的功能活性，从而产生抗凝作用。国内外大量研究发现：VKORC1基因突变会增加该酶对华法林的敏感性，从而增强抗凝效果，其中比较常见的突变有启动子区的G-1639A突变及1号内含子的C1173T突变。目前研究已经证实1639G>A和1173C>T两个位点是完全连锁的。VKORC1-1693AA(1173TT)基因型患者需要的华法林剂量显著低于1693GA或GG(1173TC或CC)。美国食品药品监督管理局(FDA)明确指出：在使用华法林时，建议检测VKORC1基因型。目前医院用于VKORC1基因检测的“金标准”是PCR-直接测序法，但直接测序法的操作程序较复杂，敏感性不高，仅能检测出20-30％以上的突变株等。相比于直接测序法，ARMS-TaqMan法的灵敏性更高、成本更低。ARMS也称作等位基因特异性PCR(AlleleSpecificPCR，AS-PCR)，其原理是PCR引物的3’端末位碱基与其模板DNA存在错配时，一般将导致扩增效率急剧下降，设计等位基因特异性PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3’碱基与模板配对时才能出现PCR扩增信号，从而检测出突变。实时荧光定量PCR(Real-timeQuantitativePCR，QPCR)技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。QPCR技术一般分为探针法和染料法，本试剂盒采用的是TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。目前市场上还没有利用ARMS结合QPCR技术进行VKORC1的基因多态性检测的产品。
技术实现思路
为了解决上述方法检测VKORC1基因分型过程中存在敏感性不高、检测周期长、操作繁琐及成本高的技术问题，本专利技术提供一种敏感性高、特异性强、检测周期短、操作简单并有效满足临床检验要求的检测VKORC1基因分型的引物探针组及试剂盒。本专利技术提供了一种检测VKORC1基因分型的引物探针组，所述VKORC1基因检测的多态性位点为G1639A，所述引物探针组包括：扩增VKORC1野生型和突变型的通用下游引物：5’-GCCAGGCTTGTCTTAAACTCC-3’(SEQIDNO.1)；扩增VKORC1野生型和突变型的通用探针：5’FAM-ACCTCAAGTGATCCACCCACCTCGGC-TAMRA3’(SEQIDNO.2)；扩增VKORC1野生型的上游引物：5’-CCTGAAAAACAACCATTGGACG-3’(SEQIDNO.3)；扩增VKORC1突变型的上游引物：5’-CCTGAAAAACAACCATTGGACA-3’(SEQIDNO.4)；及扩增内控GAPDH基因的上游引物：5’-CACATGGCCTCCAAGGAGTAA-3’(SEQIDNO.5)；扩增内控GAPDH基因的下游引物：5’-TGAGGGTCTCTCTCTTCCTCTTGT-3’(SEQIDNO.6)；扩增内控GAPDH基因的探针：5’JOE-CTGGACCACCAGCCCCAGCAAG-TAMRA3’(SEQIDNO.7)。本专利技术还提供了一种检测VKORC1基因分型的试剂盒，所述VKORC1基因检测的多态性位点为G1639A，所述试剂盒包括：PCR反应液1，所述PCR反应液1含有SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6及SEQIDNO.7所示的扩增引物及探针；PCR反应液2，所述PCR反应液2含有SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6及SEQIDNO.7所示的扩增引物及探针。在本专利技术提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述试剂盒还包括阳性对照品，其为插有SEQIDNO.1和SEQIDNO.3扩增产物的VKORC1野生纯合子质粒，插有SEQIDNO.1和SEQIDNO.4扩增产物的VKORC1突变纯合子质粒，插有SEQIDNO.5和SEQIDNO.6扩增产物的内控GAPDH质粒的上述三种质粒组成的质粒混合物；其中，质粒载体为pMD18-T质粒；所述质粒混合物中VKORC1突变纯合子质粒、VKORC1野生纯合子质粒和内控GAPDH质粒的数量比为1：1：2。在本专利技术提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述试剂盒还包括空白对照品，所述空白对照品为超纯水。在本专利技术提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述PCR反应液1-2中其他组分为常规的2xMixBuffer和H2O，PCR反应参数及体系为:95℃30s；95℃10s，60℃30s(采集荧光)，进行50个循环，原料名称加入量(μL)2xMixBuffer(含ROX)12.5上游引物0.5下游引物0.5探针0.5内控上游引物0.5内控下游引物0.5内控探针0.5DNA模板1去离子水8.5总体积25本专利技术还提供了如上所述的引物探针组在制备用于检测VKORC1基因分型的试剂中的应用。相较于现有技术，本专利技术提供的检测VKORC1基因分型的引物探针组及试剂盒具有以下有益效果：一、通过利用ARMS技术结合QPCR技术设计了灵敏度高和特异性好的引物探针组及其试剂盒，使得所述试剂盒在检测VKORC1基因分型时，具有定性准确，灵敏度高及特异性强的优点；此外，还具有样品处理简单、测序步骤简单、测序速度快、一个小时完成一次上机反应、直接给出检测位点荧光曲线及结果直观的优点；二、通过利用ARMS技术结合QPCR技术设计了灵敏度高和特异性好的引物探针组及其试剂盒，使得所述试剂盒在检测VKORC1基因分型时，可实时监测反应进程、反应时间短、操作简便及高通量样品检测，PCR反应同时进行荧光采集，并比金标准方法，即毛细管电泳测序法灵敏度更高，更适合用于突变分析及临床检验；三、通过在所述试剂盒中设置了空白对照品和阳性对照品，使得所述试剂盒在检测VKORC1基因分型时，可以更好的确保检测结果的准确性。附图说明图本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测VKORC1基因分型的引物探针组，其特征在于，所述VKORC1基因检测的多态性位点为G1639A，所述引物探针组包括：扩增VKORC1野生型和突变型的通用下游引物：5’‑GCCAGGCTTGTCTTAAACTCC‑3’；扩增VKORC1野生型和突变型的通用探针：5’FAM‑ACCTCAAGTGATCCACCCACCTCGGC‑TAMRA 3’；扩增VKORC1野生型的上游引物：5’‑CCTGAAAAACAACCATTGGACG‑3’；扩增VKORC1突变型的上游引物：5’‑CCTGAAAAACAACCATTGGACA‑3’；及扩增内控GAPDH基因的上游引物：5’‑CACATGGCCTCCAAGGAGTAA‑3’；扩增内控GAPDH基因的下游引物：5’‑TGAGGGTCTCTCTCTTCCTCTTGT‑3’；扩增内控GAPDH基因的探针：5’JOE‑CTGGACCACCAGCCCCAGCAAG‑TAMRA 3’。

【技术特征摘要】
1.一种检测VKORC1基因分型的引物探针组，其特征在于，所述VKORC1基因检测的多态性位点为G1639A，所述引物探针组包括：扩增VKORC1野生型和突变型的通用下游引物：5’-GCCAGGCTTGTCTTAAACTCC-3’；扩增VKORC1野生型和突变型的通用探针：5’FAM-ACCTCAAGTGATCCACCCACCTCGGC-TAMRA3’；扩增VKORC1野生型的上游引物：5’-CCTGAAAAACAACCATTGGACG-3’；扩增VKORC1突变型的上游引物：5’-CCTGAAAAACAACCATTGGACA-3’；及扩增内控GAPDH基因的上游引物：5’-CACATGGCCTCCAAGGAGTAA-3’；扩增内控GAPDH基因的下游引物：5’-TGAGGGTCTCTCTCTTCCTCTTGT-3’；扩增内控GAPDH基因的探针：5’JOE-CTGGACCACCAGCCCCAGCAAG-TAMRA3’。2.一种检测VKORC1基因分型的试剂盒，其特征在于，所述VKORC1基因检测的多态性位点为G1639A，所述试剂盒包括：PCR反应液1，所述PCR反应液1含有SEQIDNO....

【专利技术属性】
技术研发人员：滕祥云，尹贞，
申请(专利权)人：长沙三济生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43