本发明专利技术属于核酸扩增技术领域，涉及一种用于实时检测NASBA产物的高特异探针及检测NASBA产物的方法。本发明专利技术所述高特异探针由两条毗邻的核苷酸序列组成，所述两条毗邻的核苷酸序列3’端第1‑4位碱基均为核糖核苷酸碱基，其余碱基均为脱氧核糖核苷酸碱基。本发明专利技术所述高特异探针应用于NASBA扩增产物的检测，灵敏度高，特异性强，且缩短了检测时间，使得NASBA检测技术可更好的应用于病原微生物的核酸检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于核酸扩增
，涉及一种用于实时检测NASBA产物的高特异探针。
技术介绍
近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，基于核酸检测的诊断方法已大量建立并广泛应用于分子诊断试剂中。恒温扩增技术是继PCR技术后发展起来的一门新型的体外核酸扩增技术。目前恒温扩增技术主要有：滚环核酸扩增、环介导等温扩增、链置换扩增、依赖核酸序列扩增和解链酶扩增等。恒温扩增具有快速、高效、特异性好等优点，且无需专用设备。依赖核酸序列的扩增技术(Nucleic Acid Sequence Based Amplification)，即NASBA扩增技术，是在PCR基础上发展起来的一种扩增RNA的新技术。NASBA是由一对带有T7启动子序列的引物介导的、在体外特异性并连续均一的对单链RNA进行恒温扩增的过程。在41℃恒温条件下，在反应速度方面，NASBA扩增1h可将模板RNA扩增约109～1012倍，而通常的PCR反应需要2～3h。在检测灵敏度方面，NASBA可以检测到溶液中低于10gene copies/μL的痕量靶标，而PCR的检测限在100gene copies/μL左右。因此，NASBA技术无论是扩增效率还是检测灵敏度都高于RT-PCR技术。而又由于NASBA的反应仅需要一个41℃的恒温条件，水浴锅即可满足反应要求，不需要复杂的升降温等常规PCR所依赖的温控设备，因此NASBA技术的仪器成本非常低廉。与相应的检测技术结合，NASBA还具有操作简便、特异性强、灵敏度高等诸多优点，已广泛应用于病原体、肿瘤诊断和监控、疾病易发性检测、兽疾诊断等领域。目前，NASBA扩增产物的检测主要包括直接检测、SBA电化学发光技术、寡核苷酸检测和SBA分子信标检测。直接检测即采用电泳凝胶的方式进行检测，属于初步检测反应产物；SBA电化学发光技术灵敏度高，但所需时间长。SBA分子信标检测灵敏度相对于SBA电化学发光技术略低，但所需时间短。NASBA扩增产物在线检测最常用的为分子信标的方法，但由于NASBA扩增反应由三酶联合共同作用，且三酶所用浓度相对较高，对体系中的核酸攻击性强，随着反应时间的延长，使得体系中的分子信标易于引物发生非特异性反应，造成假阳性信号的产生，导致结果误判，对后续诊断带来一定的困难。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的为了解决上述问题，本专利技术提供了一种用于实时检测NASBA产物的高特异探针，采用毗邻探针代替分子信标，可有效的避免上述问题，提高了NASBA扩增产物在线检测的特异性。为了实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案。一种高特异探针，其特征在于，由两条毗邻的核苷酸序列组成，所述两条毗邻的核苷酸序列3’端第1-4位碱基均为核糖核苷酸碱基，其余碱基均为脱氧核糖核苷酸碱基。本专利技术提供的NASBA产物检测的高特异探针由两条毗邻核苷酸序列组成，分别命名为探针Probe F和探针Probe R，所述两条毗邻核苷酸序列的组成均为核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸，核苷酸序列的3’端第1-4位碱基均为核糖核苷酸碱基，5’端均为脱氧核糖核苷酸碱基。本专利技术所述高特异探针中的两条毗邻核苷酸序列的链长为8-18个碱基。在一些实施方案中，所述高特异探针中的两条毗邻核苷酸序列的链长为10-13个碱基。本专利技术所述高特异探针中的两条毗邻核苷酸序列与NASBA扩增产物通过碱基互补配对结合。所述探针Probe-F结合于单链RNA产物的上游，探针Probe-R结合在单链RNA产物的下游。本专利技术所述高特异探针中的两条毗邻核苷酸序列与NASBA扩增产物结合后两条链之间的距离为0-8个碱基之间。所述高特异探针中的两条毗邻核苷酸序列中处于上游的一条核酸序列Probe-F的3’端标记有荧光报告基团，处于下游的一条核酸序列的5’端标记有荧光淬灭基团Probe-R。当无NASBA扩增产物时，两条毗邻核苷酸序列游离于体系中，发射荧光，可检测到强荧光信号。当有NASBA扩增产物时，所述两条毗邻核苷酸序列与NASBA扩增产物结合后，Probe-F的3’端的荧光报告基团与Probe-R的5’端的荧光淬灭基团非常接近，荧光分子发出的荧光被淬灭分子吸收，并以热能形式散失，使体系中荧光信号降低，实时检测显示数据为倒S形曲线。其中，所述Probe-F的3’端标记的荧光报告基团可以为FAM，TET，HEX，JOE，CY3，CY5，ROX，Texas Red等。所述Probe-R的5’端标记荧光淬灭基团可以为TAMRA，BHQ1，BHQ2，CY5等。本专利技术所述的高特异探针在阴性对照试验中扩增6h仍有良好的特异性，无非特异扩增，表明所述高特异探针在NASBA产物实时检测中有很强的特异性。因此本专利技术还提供了上述高特异探针在NASBA扩增产物的实时在线检测中应用。本专利技术还提供了一种NASBA扩增产物的实时在线检测方法，取包含所述高特异探针的恒温扩增缓冲液与恒温扩增酶溶液、RNA模板混合成反应体系，置于在实时荧光定量PCR仪中，在41℃反应1小时。其中，所述恒温扩增缓冲液中高特异探针浓度优选为0.01μM-1μM。在一些实施方案中，所述高特异探针浓度为0.1μM。优选的，所述反应体系中所述恒温扩增缓冲液与恒温扩增酶溶液、RNA模板的体积比为7:1:2。在一些实施方案中，所述恒温扩增缓冲液其组成如下：恒温扩增缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：200mM Tris-HCL(pH 8.0)，0.5μM上游引物，0.5μM下游引物，0.1μM上游探针Probe-F，0.1μM下游探针Probe-R，50mM DTT，10mM dNTP，10mM rNTP，80mM MgCl2，450mM KCl，15％体积百分含量DMSO，1M山梨糖醇，20mM四甲基氯化铵。在一些实施方案中，所述恒温扩增酶溶液的溶剂为水，溶质及浓度如下：AMV逆转录酶1U/μL，T7RNA聚合酶5U/μL，核糖核酸酶H 0.5U/μL，焦磷酸酶0.5U/μL，RNA酶抑制剂5U/μL，BSA 0.5μg/μL。由上述技术方案可知，本专利技术提供了一种用于实时检测NASBA产物的高特异探针及检测NASBA产物的方法。本专利技术所述高特异探针由两条毗邻的核苷酸序列组成，所述两条毗邻的核苷酸序列3’端第1-4位碱基均为核糖核苷酸碱基，其余碱基均为脱氧核糖核苷酸碱基。本专利技术所述高特异探针应用于NASBA扩增产物的检测，灵敏度高，特异性强，且缩短了检测时间，使得NASBA检测技术可更好的应用于病原微生物的核酸检测。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示实施例2毗邻探针检测NSABA扩增产物；其中，图a为甲型流感通用检测引物InfA-TY-PrimerF，InfA-TY-PrimerR，和探针InfA-TY-PrimerF、InfA-TY-PrimerR检测扩增曲线，线1为阴性对照组检测结果，线2为扩增甲型流感MP基因RNA的检测结果；图b为甲型流感H1亚型引物InfA-H1-PrimerF、InfA-H1-PrimerR，和探针InfA-H1-ProbeF、InfA-H1-ProbeR检测扩增曲线，线1为阴性对照组检测结果，线2为扩增甲型流感本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高特异探针，其特征在于，由两条毗邻的核苷酸序列组成，所述两条毗邻的核苷酸序列3’端第1‑4位碱基均为核糖核苷酸碱基，其余碱基均为脱氧核糖核苷酸碱基。
【技术特征摘要】
1.一种高特异探针，其特征在于，由两条毗邻的核苷酸序列组成，所述两条毗邻的核苷酸序列3’端第1-4位碱基均为核糖核苷酸碱基，其余碱基均为脱氧核糖核苷酸碱基。2.根据权利要求1所述的高特异探针，其特征在于，所述两条毗邻的核苷酸序列每条链链长均在8-18碱基之间。3.根据权利要求1或2所述的高特异探针，其特征在于，所述两条毗邻的核苷酸序列与NSABA扩增产物碱基互补配对。4.根据权利要求3所述的高特异探针，其特征在于，两条毗邻的核苷酸序列与NSABA扩增产物碱基互补配对结合后，两条链之间的距离为0-8个碱基之间。5.根据权利要求1-4任意一项所述的高特异探针，其特征在于，两条毗邻的核酸序列中处于上游的一条核酸序列的3’端标记有荧光报告基团，处于下游的一条核酸序列的5’端标记有荧光淬灭基团。6.根据权利要求5所述的高特异探针，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM、TET、HEX、JOE、CY3、CY5、ROX或Texas Red；所述荧光淬灭基团为TAMRA、BHQ1、BHQ2或CY5。7.权利要求1-6任意一项所述高特异探针在NASBA扩增产物的实时在线检测中应用。8.一种NASBA扩增产物的实时在线检测方法，其特征在于，取...
【专利技术属性】
技术研发人员：张岩，盖伟，邢婉丽，单万水，刘厚明，宋翠丹，程京，
申请(专利权)人：博奥生物集团有限公司，深圳市第三人民医院，
类型：发明
国别省市：北京;11
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