【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种基于crispr/cas微流控芯片用于单外泌体蛋白与rna共检测的液滴检测方法。
技术介绍
1、细胞外囊泡（extracellular vesicles，evs）是由一类由活细胞主动分泌的异质性囊泡。是一种内部包裹着核酸蛋白，表面分布各种分子的独立囊泡，该能够反应其母源细胞的状态，并提供多维度信息，已被报道用于各种疾病，如肿瘤，结核，阿尔兹海默症等疾病的检测。然而由于细胞外囊泡很小，其中外泌体的大小仅在50-200nm，且特定组织来源的外泌体丰度低，异质性高，使研究细胞外囊泡作为疾病标志物的一直有困难。单外泌体层面的检测，能够建立单外泌体与单细胞之间的联系来找出疾病部位，同时外泌体检测能分辨多外泌体检测中被背景掩盖的信息。然而目前单外泌体检测领域还在起步阶段，检测指标单一，灵敏度差，信噪比低，且需要依赖大型仪器设备，不足以支撑基于单外泌体的检测指标开发以及临床应用环境下的灵敏、快速、多指标的检测。
2、近5年来，基于crispr/cas(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，crispr)的检测方案被广泛应用于诊断。它们最早于20世纪80年代在大肠杆菌中被发现。crispr/cas系统最早被认为是细菌的一种适应性免疫系统，该系统可以通过特异性切割外源dna或rna来保护细菌。后来，由于crispr/cas检测方法与传统pcr相比具有较高的灵敏度，crispr开始被用作诊断工具。
3、cas12a是一
4、学术界目前检测单外囊泡的方案有纳米流式，全内反射显微镜，拉曼光谱，数字pcr等，但这些方法大部分都是针对表面蛋白进行检测的。目前仅能通过递送分子信标的办法去检测外囊泡内部的rna，该方法最早由l james lee课题组2013年最先发表在analchem杂志上，用做肺癌检测。然而该方案的信噪比很低。分子信标本身有一个着茎环结构，在未结合rna时，通过茎环结构把荧光基团和粹灭集团拉近，从而粹灭荧光。当结合rna时，结构打开，荧光基团和粹灭基团距离增大，从而释放荧光信号。然而单个分子信标只能结合单个rna分子，释放一个单位的荧光，没有扩增过程，所以信号低；同时分子信标的茎环结构在水溶液中不够稳定，这导致了高背景。这两点结合最终造成了单外囊泡rna检测时信噪比很低。
5、为了改善该方案下的缺陷，很多课题组有基于分子信标方案进行了一系列的优化，比如2017年，在nc中加入催化发夹型dna自组装反应反应，放大信号；2018年materials上改变分子信标结构，减少分子信标不稳定性等等。science avdance，复旦大学白春学老师发的文章是l james lee课题组的延伸应用，细化了检测条件，并且改用tirf减少背景荧光信号。这些优化一定程度上改善了信噪比，但仍不够理想。此外这些方案大都需要依赖大型仪器，也不太适用于医院等需要即时检测的环境。
6、近些年也有一些基于中小型仪器做单外囊泡检测的公司，目前已有的检测方法有，今年十月份刚发布的exostar和2018年发布的exoview。前者和ddpcr类似，需要用dna标记的抗体去识别外囊泡，通过液滴包裹，并pcr的方式去检测表面蛋白；后者则是直接用荧光成像，单粒子干涉反射成像的方式检测单外囊泡。然而这两者目前也仅能做到表面蛋白检测，且价格昂贵，需要1000多块钱一个样本。
7、为了解决现有单外囊泡蛋白与rna共检测技术中信噪比低，需要依赖大型仪器，价格昂贵，不适用于医院等即时检测环境的缺陷，提供一种能提高rna检测的信噪比，价格更为低廉的检测方法具有重要意义。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了一种基于crispr/cas微流控芯片用于单外泌体蛋白与rna共检测的液滴检测方法。本专利技术提供了一种基于crispr/cas微流控芯片用于单外泌体蛋白与rna共检测的液滴检测方法。为了解决现有单外囊泡蛋白与rna共检测技术中信噪比低，需要依赖大型仪器，价格昂贵，不适用于医院等即时检测环境的缺陷，本专利技术的目的在于，提供一种基于液滴crispr/cas共检测单外囊泡蛋白与rna的新技术，显著提高rna检测的信噪比，同时基于小型的微流控芯片能够在2小时内在医院等环境下报告结果。同时本方案的价格更为低廉，具有更好的市场前景。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供了单外囊泡中rna和蛋白共检测的组合物，包括cas13a、激活cas13a的核酸分子、cas12a和激活cas12a的核酸分子；
4、所述激活cas13a的核酸分子包括所述cas12a激活后释放的rna。
5、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述组合物还包括表面活性剂。
6、在本专利技术的一些具体实施方案中，
7、（1）、所述激活cas13a的核酸分子具有如seq id no.3所示的核苷酸序列；或
8、（2）、所述激活cas12a的核酸分子具有如seq id no.5所示的核苷酸序列；或
9、（3）、与（1）或（2）所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与（1）或（2）所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
10、（4）、与（1）~（3）任一项所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与（1）~（3）任一项所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
11、（5）、与（1）~（4）任一项所述核苷酸序列具有至少80%序列同源性的核苷酸序列。
12、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述激活cas12a的核酸分子：
13、（6）、具有如seq id no.1或7所示的核苷酸序列；或
14、（7）、与（6）所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与（6）所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
15、（8）、与（6）或（7）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与（6）或（7）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
16、（9）、与（6）~（8）任一项所述核苷酸序列具有至少80%序列同源性的核苷酸序列。
17、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述表面活性剂包括但不限于triton x-100或triton x-本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.单外囊泡中RNA和蛋白共检测的组合物，其特征在于，包括Cas13a、激活Cas13a的核酸分子、Cas12a和激活Cas12a的核酸分子；
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，还包括表面活性剂；
3.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，
4.如权利要求1至3任一项所述的组合物，其特征在于，所述激活Cas12a的核酸分子：
5.共反应缓冲液，其特征在于，包括Tris-HCl、MgCl2、KCl、PVA、DTT、表面活性剂和BSA；
6.如权利要求5所述的共反应缓冲液，其特征在于，所述Tris-HCl的浓度为20~80 mM；所述MgCl2的浓度为1~10mM；所述KCl的浓度为5~50 mM；所述表面活性剂的浓度为0.1~1%；所述PVA的浓度为0.2~4%；所述DTT的浓度为0.5~5 mM；所述BSA的浓度为10~100 μg/mL。
7.Cas12a和Cas13a共反应体系，其特征在于，包括如权利要求1至4任一项所述的组合物和如权利要求5或6所述的共反应缓冲液。
8.如权利要求
9.如权利要求7或8所述的Cas12a和Cas13a共反应体系，其特征在于，所述组合物中的Cas13a的浓度为10-20 nM；所述Cas13a gRNA的浓度为1-10 nM；所述Cas13a reporter的浓度为500 nM-1μM；所述组合物中的Cas12a的浓度为20-100 nM；所述Cas12a gRNA的浓度为25-125 nM；所述Cas12a reporter的浓度为500 nM-1 μM；所述RNase抑制剂的浓度为1-2U/μL。
10.微流控芯片，其特征在于，负载如下任意项：
11.装置，其特征在于，包括如下任意项：
12.如下任意项在共检测单外囊泡中RNA和蛋白中的应用：
13.如下任意项在制备癌症筛查的试剂或试剂盒中的应用：
14.试剂盒，其特征在于，包括如下任意项：
...【技术特征摘要】
1.单外囊泡中rna和蛋白共检测的组合物，其特征在于，包括cas13a、激活cas13a的核酸分子、cas12a和激活cas12a的核酸分子；
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，还包括表面活性剂；
3.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，
4.如权利要求1至3任一项所述的组合物，其特征在于，所述激活cas12a的核酸分子：
5.共反应缓冲液，其特征在于，包括tris-hcl、mgcl2、kcl、pva、dtt、表面活性剂和bsa；
6.如权利要求5所述的共反应缓冲液，其特征在于，所述tris-hcl的浓度为20~80 mm；所述mgcl2的浓度为1~10mm；所述kcl的浓度为5~50 mm；所述表面活性剂的浓度为0.1~1%；所述pva的浓度为0.2~4%；所述dtt的浓度为0.5~5 mm；所述bsa的浓度为10~100 μg/ml。
7.cas12a和cas13a共反应体系，其特征在于，包括如权利要求1至4任一项所述的组合物和如权利要求5或6所述的共反应缓冲液。
8.如权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐璕，张渊越，程京，
申请(专利权)人：博奥生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：
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