【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及消毒，尤其是涉及一种用于现场模拟消毒效果评价的快速检测金黄色葡萄球菌的引物探针组合、方法及试剂盒。
技术介绍
1、突发公共卫生事件严重危害人民生命健康，对国家安全、社会稳定和经济发展造成严重后果。
2、消毒是落实“人-物-环境同防”、切断病原体传播途径的有效措施和手段，而对消毒效果进行准确评价是保证消毒有效的必然途径和要求。目前国外用于直接现场消毒效果评价方面的标准及方法研究报道较少，大多根据各国消毒产品功效检测标准，对特定病原微生物进行实验室模拟现场消毒功效试验研究，如对hana流感病毒、诺如病毒、埃博拉病毒等开展的模拟现场消毒评价。世界卫生组织(who)、美国疾病预防控制中心(uscdc)、欧洲疾病预防控制中心(ecdc)和我国发布的重要传染病(如埃博拉出血热、中东呼吸综合征)防控方案中尤其对消毒过程评价时，仅强调采取消毒处置时所用的产品是否合格以及使用严格按照说明书操作，均未提及并强化针对消毒效果的评价要求。
3、目前我国针对突发公共卫生事件处置的现场消毒效果的评价标准，已有卫生系统行业标准《消毒技术规范》(2002)、《现场消毒评价标准》ws/t 797和国家标准《疫源地消毒总则》gb19193-2015，要求原则上消毒后不得检测病原微生物(含细菌、病毒、真菌、芽孢、朊毒体)或者是消毒后自然菌杀灭率须≥90％。以上标准要求不得检出目标病原微生物为前提，但是实际情况下现场很难检出目标微生物，对于目标微生物无法检测、传染病疫源地原因不明、风险等级较高等发生突发公共卫生事件进行消毒效果评价
4、实现对消毒效果快速、准确评价的关键环节是对细菌定量检测。作为第三代核酸扩增技术，微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddpcr)可实现对dna分子的绝对定量，不需要内参基因和标准曲线，可直接给出靶序列的拷贝数，具有良好的灵敏性和重复性，易于标准化。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的是提供一种用于现场模拟消毒效果评价的快速检测金黄色葡萄球菌的引物探针组合、方法及试剂盒，以解决上述的技术问题。
2、本专利技术的上述专利技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
3、一种用于现场模拟消毒效果评价的快速检测金黄色葡萄球菌的引物探针组合，包括由oligo 1(nuc)forward序列、oligo 2(nuc)reverse序列以及oligo 3(nuc)forward序列组成的nuc的扩增引物。
4、作为本专利技术的进一步的技术方案：所述oligo 1(nuc)forward序列由如下核苷酸序列组成：
5、探针：5’-atatggccctgaagcaagtg-3’。
6、作为本专利技术的进一步的技术方案：所述oligo 2(nuc)reverse序列由如下核苷酸序列组成：
7、探针：5’-cgctaagccacgtccatatt-3’。
8、作为本专利技术的进一步的技术方案：所述oligo 3(nuc)forward序列由如下核苷酸序列组成：
9、探针：fam’-agtcgagtttgacaaaggtcaaagaactga-bhq1’。
10、根据上述的一种用于现场模拟消毒效果评价的快速检测金黄色葡萄球菌的引物探针组合的试剂盒，扩增体系条件为：
11、7.5μl 4×probe dpcr unimix(with ung)；
12、上、下游引物各0.9μl(终浓度300nmol/l)；
13、探针0.45μl(终浓度150nmol/l)；
14、dna模板1.0μl；
15、用双蒸水补足总体积30μl。
16、作为本专利技术的进一步的技术方案：扩增反应条件为：
17、95℃预变性10min；
18、94℃变性30s；
19、60℃退火1min；
20、40个循环。
21、根据上述的一种用于现场模拟消毒效果评价的快速检测金黄色葡萄球菌的引物探针组合的方法，包括以下步骤：针对金黄色葡萄球菌种属鉴定特异性基因设计引物并合成，使用标准菌株和环境、食品分离株进行了大量、反复验证，进而对标准菌株梯度稀释的菌悬液浓度与其对应的ddpcr定量检测结果进行相关性分析，然后对现场模拟样本进行平板计数和ddpcr定量检测结果进行比较分析。
22、综上所述，本专利技术包括以下至少一种有益技术效果：
23、本专利技术提供一种用于现场模拟消毒效果评价的快速检测金黄色葡萄球菌的引物探针组合、方法及试剂盒，该方法针对金黄色葡萄球菌种属鉴定特异性基因设计引物并合成，建立微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddpcr)，对金黄色葡萄球菌进行绝对定量。使用标准菌株和环境、食品分离株进行了大量、反复验证，进而对标准菌株梯度稀释的菌悬液浓度与其对应的ddpcr定量检测结果进行相关性分析，对现场模拟样本进行平板计数和ddpcr定量检测结果进行比较分析，结果证实本专利构建了一种快速、高效、绝对定量的针对金黄色葡萄球菌的检测方法，可用于现场消毒效果(尤其是突发公共卫生事件处置)的现场模拟评价的金黄色葡萄球菌的快速检测。
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1.一种用于现场模拟消毒效果评价的快速检测金黄色葡萄球菌的引物探针组合，其特征在于，包括由Oligo 1(nuc)Forward序列、Oligo 2(nuc)Reverse序列以及Oligo 3(nuc)Forward序列组成的nuc的扩增引物。
2.根据权利要求1所述的一种用于现场模拟消毒效果评价的快速检测金黄色葡萄球菌的引物探针组合，其特征在于，所述Oligo 1(nuc)Forward序列由如下核苷酸序列组成：
3.根据权利要求1所述的一种用于现场模拟消毒效果评价的快速检测金黄色葡萄球菌的引物探针组合，其特征在于，所述Oligo 2(nuc)Reverse序列由如下核苷酸序列组成：
4.根据权利要求1所述的一种用于现场模拟消毒效果评价的快速检测金黄色葡萄球菌的引物探针组合，其特征在于，所述Oligo 3(nuc)Forward序列由如下核苷酸序列组成：
5.根据权利要求1-4任意一项所述的一种用于现场模拟消毒效果评价的快速检测金黄色葡萄球菌的引物探针组合的试剂盒，其特征在于，扩增体系条件为：
6.根据权利要求5所述
7.根据权利要求1-4任意一项所述的一种用于现场模拟消毒效果评价的快速检测金黄色葡萄球菌的引物探针组合的方法，其特征在于，包括以下步骤：针对金黄色葡萄球菌种属鉴定特异性基因设计引物并合成，使用标准菌株和环境、食品分离株进行了大量、反复验证，进而对标准菌株梯度稀释的菌悬液浓度与其对应的ddPCR定量检测结果进行相关性分析，然后对现场模拟样本进行平板计数和ddPCR定量检测结果进行比较分析。
...【技术特征摘要】
1.一种用于现场模拟消毒效果评价的快速检测金黄色葡萄球菌的引物探针组合，其特征在于，包括由oligo 1(nuc)forward序列、oligo 2(nuc)reverse序列以及oligo 3(nuc)forward序列组成的nuc的扩增引物。
2.根据权利要求1所述的一种用于现场模拟消毒效果评价的快速检测金黄色葡萄球菌的引物探针组合，其特征在于，所述oligo 1(nuc)forward序列由如下核苷酸序列组成：
3.根据权利要求1所述的一种用于现场模拟消毒效果评价的快速检测金黄色葡萄球菌的引物探针组合，其特征在于，所述oligo 2(nuc)reverse序列由如下核苷酸序列组成：
4.根据权利要求1所述的一种用于现场模拟消毒效果评价的快速检测金黄色葡萄球菌的引物探针组合，其特征在于，所述oligo ...
【专利技术属性】
技术研发人员：张红芝，吴寰宇，毕菁，陈敏，梁英英，田靓，刘倩，陈雯杰，陈泰尧，葛忆琳，
申请(专利权)人：上海市预防医学研究院，
类型：发明
国别省市：
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