【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，特别是涉及一种无抗生素筛选的转基因通用载体pcamt2aruby及其应用。
技术介绍
1、转基因技术是生物工程中各科学领域的重要关键应用技术，对阳性转基因生物的筛选是转基因技术中不可缺少的重要一环。目前在筛选转基因植株过程中，通常借助使用抗生素、药剂(如除草剂)或特殊仪器(如荧光显微镜)筛选转基因阳性植株，具有操作复杂，要求严格等特点。
2、目前应用于转基因植物筛选的抗生素抗性基因主要有卡那霉素抗性基因(kanr)和潮霉素抗性基因(hygr)。卡那霉素和潮霉素通过与植物细胞内核糖体的结合，致使mrna密码误读，使植物的蛋白质生物合成受到抑制，最终导致植物死亡。当将植株或种子在含有抗生素的培养基上生长时，由于非转基因植株没有抗性基因导致幼苗在10-30天内死亡，而转有kanr或hygr的转基因植株因为具有抗性基因并合成正常的抗性蛋白而存活下来，从而达到筛选出阳性转基因植株的目的。抗生素抗性基因的应用需要在无菌条件下完成筛选过程，操作环境和操作步骤要求严格。
3、除草剂抗性基因主要有草甘膦抗性基因和草胺膦抗性基因。草甘膦和草胺膦可通过抑制植物体内的烯醇丙酮基莽草素磷酸合成酶，从而抑制莽草素向苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的转化，使蛋白质合成受到干扰，最终导致植物死亡。当使用除草剂喷洒植株时，没有除草剂抗性的非转基因植株在7-15天内死亡；而由于转基因植株具有除草剂抗性而存活下来，从而达到快速筛选出转基因抗性植株的目的。
4、使用报告基因来指示和筛选植物的遗传转化是否成功也是一种常
5、以上所述抗生素抗性基因、抗除草剂基因和报告基因均已广泛使用，且均已有相应的可供广泛使用的通用载体使用，但在不借助使用抗生素、药剂或仪器的情况下安全快速筛选出阳性植株的技术方面有待进一步改进。如pbi121、pcame、pcambia1300及其系列载体。其中pbi121载体使用了卡那霉素抗性基因(kanr)和报告基因gus，在筛选和鉴定转基因植株时需要使用抗生素卡那霉素，报告基因gus需要使用特殊染色药剂经过复杂处理后才能够呈现出兰色，且对植株体造成不可恢复的取材伤害。pcambia1300及其系列载体使用了潮霉素抗性基因(hypr)，没有使用报告基因，在筛选和鉴定转基因植株时需要使用抗生素潮霉素，且使用者在添加目的基因的同时需要继续添加启动子和终止子等基因组件以保障外来目的基因的正确转录和终止。专利技术人在2012年已获得专利授权的pcame载体(专利号：zl201210323707)具有一定的先进性，没有使用报告基因，在添加目的基因时不需要继续添加启动子和终止子等基因组件，但在筛选转基因植株时需要使用抗生素潮霉素。因此，有必要开发一种环境要求简单、技术操作简单、可快捷方便筛选观察的高效转基因通用载体。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种无抗生素筛选的转基因通用载体pcamt2aruby及其应用，以解决上述技术瓶颈。本专利技术提供的载体①可以在不需要另外添加启动子和终止子等基因组件的情况下，直接添加目的基因序列，即可完成以ruby做为报告基因的载体构建和遗传转化；②使用该载体进行植物遗传转化时不受植物物种限制，可广泛应用于植物的遗传转化；③获得的转基因植株整体呈红色，可在不借助使用任何抗生素、药剂或仪器的情况下，仅通过裸眼观察即可安全无损伤的直接快速筛选出转基因植株，较目前常用同类载体更简便、经济和安全；④预留了多克隆位点sali/apai/xbai/saci，可用于目的基因的插入构建；⑤载体大小仅为11859bp，较常用植物表达载体pbi121(14758bp)少2899bp，具有载体基因序列小，遗传转化效率高的特点。⑥另外该载体可使转基因植株的白色花瓣呈现鲜艳红色，增加了花色选择。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
3、本专利技术提供一种转基因通用载体pcamt2aruby，所述转基因通用载体pcamt2aruby的序列如seq id no.5所示。
4、本专利技术还提供一种以所述的转基因通用载体pcamt2aruby为骨架构建的重组载体。
5、进一步地，所述重组载体包括序列如seq id no.6所示的载体pcamsruby。
6、本专利技术还提供含有所述的重组载体转基因通用载体pcamt2aruby或所述的重组载体的宿主菌。
7、本专利技术还提供所述的转基因通用载体pcamt2aruby、所述的重组载体或所述的宿主菌在基因转化中的应用。
8、本专利技术还提供所述的转基因通用载体pcamt2aruby、所述的重组载体或所述的宿主菌在制备转基因植物中的应用。
9、本专利技术还提供一种制备转基因植物的方法，包括将目的基因导入所述的转基因通用载体pcamt2aruby或所述的重组载体中，获得带有目的基因的重组载体，将所述带有目的基因的重组载体导入目的植物中，获得含有所述目的基因的转基因植物。
10、进一步地，所述植物包括拟南芥和棉花。
11、本专利技术还提供所述的转基因通用载体pcamt2aruby、所述的重组载体或所述的宿主菌在改变植株颜色中的应用。
12、本专利技术还提供一种改变植株颜色的方法，包括将所述的转基因通用载体pcamt2aruby或所述的重组载体导入目的植物中，使获得的转基因植物植株颜色改变。
13、本专利技术公开了以下技术效果：
14、本专利技术利用35s启动子调控基因的表达，根据植物密码子的偏好性，对表达基因的密码子进行了优化，使其更适合用于在转基因植物中的表达和应用；同时使用2a技术，引入t2a组件，缩小了载体大小，提高了遗传转化效率，最终达到了以下技术效果：①本专利技术提供的载体可以在不需要另外添加启动子和终止子等基因组件的情况下，直接添加目的基因序列，即可完成以ruby做为报告基因的载体构建和遗传转化；②使用该载体进行植物遗传转化时不受植物物种限制，可广泛应用于植物的遗传转化；③获得的转基因植株整体呈红色，可在不借助使用任何抗生素、药剂或仪器的情况下，仅通过裸眼观察即可安全无损伤的直接快速筛选本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种转基因通用载体pCamT2ARuby，其特征在于，所述转基因通用载体pCamT2ARuby的序列如SEQ ID NO.5所示。
2.一种以权利要求1所述的转基因通用载体pCamT2ARuby为骨架构建的重组载体。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体包括序列如SEQ IDNO.6所示的载体pCamSRuby。
4.含有权利要求1所述的重组载体转基因通用载体pCamT2ARuby或权利要求2或3所述的重组载体的宿主菌。
5.权利要求1所述的转基因通用载体pCamT2ARuby、权利要求2或3所述的重组载体或权利要求4所述的宿主菌在基因转化中的应用。
6.权利要求1所述的转基因通用载体pCamT2ARuby、权利要求2或3所述的重组载体或权利要求4所述的宿主菌在制备转基因植物中的应用。
7.一种制备转基因植物的方法，其特征在于，包括将目的基因导入权利要求1所述的转基因通用载体pCamT2ARuby或权利要求2或3所述的重组载体中，获得带有目的基因的重组载体，将所述带有目的基因的重组载
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述植物包括拟南芥和棉花。
9.权利要求1所述的转基因通用载体pCamT2ARuby、权利要求2或3所述的重组载体或权利要求4所述的宿主菌在改变植株颜色中的应用。
10.一种改变植株颜色的方法，其特征在于，包括将权利要求1所述的转基因通用载体pCamT2ARuby或权利要求2或3所述的重组载体导入目的植物中，使获得的转基因植物植株颜色改变。
...【技术特征摘要】
1.一种转基因通用载体pcamt2aruby，其特征在于，所述转基因通用载体pcamt2aruby的序列如seq id no.5所示。
2.一种以权利要求1所述的转基因通用载体pcamt2aruby为骨架构建的重组载体。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体包括序列如seq idno.6所示的载体pcamsruby。
4.含有权利要求1所述的重组载体转基因通用载体pcamt2aruby或权利要求2或3所述的重组载体的宿主菌。
5.权利要求1所述的转基因通用载体pcamt2aruby、权利要求2或3所述的重组载体或权利要求4所述的宿主菌在基因转化中的应用。
6.权利要求1所述的转基因通用载体pcamt2aruby、权利要求2或3所述的重组载体或权...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴立柱，马峙英，王省芬，张冬梅，豆硕，孔文慧，郭文静，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。