【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及插入片段至野生型染色体的方法。
技术介绍
1、合成生物学将工程师和生物学家联系在一起，旨在创建和组装新的生物分子组分、网络和途径，并利用这些构件对生物体进行重写和重新编程。这种学科交叉的合作促进了生物学的快速发展和创新。在合成生物学领域，合成基因组技术的进步为基因组进化和工程研究提供了强有力的支持。通过基因组最小化、遗传密码重编码、引入合成组分和数据存储等技术的应用，研究者们能够更加深入地了解生命现象的本质，推动生物技术的发展。
2、在自然界中，基因组中片段的插入与转座元件相关。转座元件是一类可以在基因组中插入或移动的dna序列。ty元件是酿酒酵母中的一个ltr逆转录转座子，它可以通过逆转录过程将自身复制插入到基因组的新位置。有研究表明，当ty1转座子插入到目标dna的某个位置时，它会导致该区域的dna序列在插入点两侧形成重复片段。转座子系统在基因插入方面的缺点在于插入效率低。一些转座子由于其内部序列的特点或者转座酶的表达水平和受到细胞内某些抑制因子的影响活性不高而导致自身的自然活性较低，影响插入效率。
3、目前研究者开发的crispr技术也可以实现酵母体内片段的插入，2013年，dicarlo等人使用crispr-cas9系统设计特定grna，与cas9蛋白结合成复合物，靶向特定基因组位点并引发dna双链断裂。在修复过程中，通过提供外源dna模板实现基因插入，这种方法已经成功用于酵母体内的基因插入。zhao等人基于crispr-cas9技术，实现单步将产物表达途径无标记插入到
4、合成酵母基因组项目(sc2.0)是合成生物学领域的一项重要成就。此项目中的其中一项应用是scramble系统(loxp介导的合成型染色体重排与修饰系统)，它是一种基于酵母人工染色体的基因组编辑技术。scramble利用了与噬菌体p1中相似的cre-loxpsym系统。在这个系统中，cre重组酶能够识别34bp的回文loxpsym位点。在合成染色体的设计中，研究者在每个非必需基因的3'utr下游插入loxpsym位点，以便后续诱导cre重组酶表达来实现染色体结构的改变。通过控制cre酶的表达，可以精确地触发scramble系统，从而在合成型染色体上诱导特定的重排事件，如删除、反转、复制和易位等，极大地增加了基因组的多样性和复杂性。先前的研究已经证实，scramble技术可以产生高频率的复制，并产生超过260,000次的重排事件。然而loxpsym位点是在合成染色体设计之初特意插入的。这些loxpsym位点作为cre酶的识别和作用目标，使得只有包含这些位点的dna区域(即合成染色体)才能通过cre酶介导的方式进行重排。自然界中的野生型染色体不包含这些特意设计的loxpsym位点，因此不易受到scramble系统的直接影响。如何利用scramble系统的实现菌株基因组的重排，还在进一步研究中。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供插入片段至野生型染色体的方法。
2、本专利技术提供了插入片段至野生型染色体的方法，包括：
3、在含有loxpsym位点的染色体中，在着丝粒两侧的2个loxpsym位点之间插入标签，然后转入含有cre酶编码核酸的质粒，获得重组菌株；
4、将所述重组菌株与野生型菌株杂交，获得二倍体菌株；
5、将二倍体菌株经scramble诱导后，筛选标签被删除的菌株。
6、利用合成型染色体的基因组重排(scramble)技术，在杂合二倍体酿酒酵母的野生型染色体上实现插入变异，而获得高产菌株。具体为：本专利技术在合成型染色体着丝粒附近加入标签，然后再在菌体内导入表达cre酶的载体。cre酶会有一定概率与着丝粒两侧的loxpsym位点相结合，从而将含有着丝粒的片段从合成型染色体上删除。整条染色体也由于着丝粒的丢失而发生碎裂，合成型片段在scramble重排过程中便可能会随机插入同源野生型染色体上，从而获得含有插入事件的菌株。此时将菌株涂布在平板上根据标签进行筛选便能获取潜在发生插入结构变异的菌株。
7、本专利技术中所述的重组菌株为单倍体菌株，野生型菌株也为单倍体菌株。
8、本专利技术中，所述含有loxpsym位点的染色体为人工合成的酿酒酵母染色体。
9、一些实施例中，所述含有loxpsym位点的染色体为人工合成的酿酒酵母v号染色体或x号染色体。酵母v号染色体或x号染色体的人工合成参见(xie et al.,2017；wu et al.,2017；xie et al.,2018)。酿酒酵母人工合成的v染色体有176个loxpsym位点，酿酒酵母人工合成的x染色体有245个loxpsym位点，在二者中插入标签，都能够实现本专利技术的技术效果。本专利技术实施例中，以v染色体为例进行效果验证。
10、本专利技术中，所述着丝粒两侧的2个loxpsym位点，分别位于着丝粒的上游和下游，是距离着丝粒最近的2个loxpsym位点。具体实施例中，将标签插入在酿酒酵母的v号染色体着丝粒两侧的loxpsym位点之间。
11、本专利技术中，标签的引入采用同源重组的方式进行，具体包括，通过pcr合成含有左右同源臂和标签的片段，然后进行转化。所述转化采用本领域熟知方法进行，例如，醋酸锂法。理论上说，左右同源臂的位置和长度对插入事件发生的影响不大。但标签插入的位置可能影响重排结果，
12、在本专利技术中，所述标签为营养缺陷型标签和/或荧光标签。例如，所述营养缺陷型标签为ura3标签、ade1标签、arg3标签、his3标签。所述荧光标签包括但不限于绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白等。本专利技术实施例中，所述标签为ura3标签。
13、本专利技术中，cre酶通过内源产生或外源给予，优选为内源产生。使菌株内源产生cre酶的方法包括导入cre酶编码基因。一些实施例中，所述含有cre酶编码核酸的质粒为游离型质粒。具体实施例中，含有cre酶编码基因的质粒上还包括pgal1，ebd，ttdh2和hygb。其中，pgal1是启动子，creebd是两个基因序列在一起的融合蛋白，ttdh2是终止子，hygb是筛选标签。所述质粒的骨架载体为prs413。更具体的，所述含有cre酶编码核酸的质粒为prs413(pgal1-creebd-ttdh2-hygb)。
14、本专利技术中，所述重组菌株和野生型菌株都是酵母菌。所述酵母菌为酿酒酵母、奇异酵母、解脂耶氏酵母或毕赤酵母。一些实施例中，所述重组菌株为a型酿酒酵母，所述野生型菌株为野生的α型酿酒酵母菌。
15、本专利技术中，以杂交获本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.插入片段至野生型染色体的方法，包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有loxPsym位点的染色体为人工合成的酿酒酵母染色体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述含有loxPsym位点的染色体为人工合成的酿酒酵母V号染色体或X号染色体。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述着丝粒两侧的2个loxPsym位点，分别位于着丝粒的上游和下游，是距离着丝粒最近的2个loxPsym位点。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标签为营养缺陷型标签和/或荧光标签。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述标签为Ura3标签。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有Cre酶编码核酸的质粒为游离型质粒。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述含有Cre酶编码核酸的质粒为pRS413(pGAL1-CreEBD-tTHD2-hygB)。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组菌株为A型酿酒酵母，所述野生型菌株为野生的α
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述SCRaMbLE诱导中，β-雌激素的浓度为1μmol/L。
11.根据权利要求1～10任一项所述的方法，其特征在于，在所述重组菌株中还包括玉米黄质、虾青素、紫色杆菌素前体和/或β-胡萝卜素的代谢路径相关基因。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，在所述重组菌株中还包括玉米黄质代谢相关基因，包括crtE基因、crtYB基因、crtI基因和/或crtZ基因。
13.根据权利要求1～12任一项所述的方法，其特征在于，在筛选标签被删除的菌株后，还包括PCR验证和/或测序验证的步骤。
14.权利要求1～13任一项所述方法构建获得的菌株。
...【技术特征摘要】
1.插入片段至野生型染色体的方法，包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有loxpsym位点的染色体为人工合成的酿酒酵母染色体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述含有loxpsym位点的染色体为人工合成的酿酒酵母v号染色体或x号染色体。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述着丝粒两侧的2个loxpsym位点，分别位于着丝粒的上游和下游，是距离着丝粒最近的2个loxpsym位点。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标签为营养缺陷型标签和/或荧光标签。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述标签为ura3标签。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有cre酶编码核酸的质粒为游离型质粒。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述含有cre酶编码核酸的质粒为prs4...
【专利技术属性】
技术研发人员：元英进，周嗣杰，李俊彦瑞，
申请(专利权)人：天津大学合成生物前沿研究院，
类型：发明
国别省市：
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