棉花Ghexp基因及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，具体涉及棉花膨胀素基因Ghexp及其在转基因植物培育中的应用。棉花膨胀素基因Ghexp核苷酸序列为SEQIDNo1。本发明专利技术的有益效果在于，克隆了棉花膨胀素基因Ghexp，并通过根癌脓杆菌介导的方法将该基因转入拟南芥，与野生型拟南芥植株相比，本发明专利技术的Ghexp基因的转基因可明显促进拟南芥植株的叶片、茎干的腺毛增多及增长，同时增加叶片的气孔密度。根据本发明专利技术，可利用基因工程方法培育转Ghexp基因植物，增加有关植株表皮毛数目，增加叶片的气孔密度，从而增加植株的次生代谢产物含量或阻碍草食动物的侵害，还可以提高植株对不良环境的适应性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种棉花膨胀素Ghexp基因，本专利技术基因对拟南芥植株的叶片腺毛具有明显的促进作用，且转基因植株叶片气孔密度增加。
技术介绍
植物腺毛是一种存在于植物体表的一种特化的突起结构，其形态多样，功能各异。(I)有的腺毛可以分泌次生代谢物质，如青蒿素、棉酚等。次生代谢产物有的具有药用价值，有的可对害虫有忌避和毒杀作用。植物次生代谢产物含量高低与其贮藏器官(比如腺体、腺毛等)的有无及多少关系十分密切。腺毛是青蒿素转移和积累的主要贮藏器官，通常以腺毛指数作为青蒿素含量的表征。唇形科的很多香料植物含有挥发性油，其挥发性油的产生与分泌则与腺毛的分布、类型及其结构等有着直接的联系。有研究表明，腺毛的分布密度越大、处于分泌时期的数量越多，其分泌能力就越强。(2)有的腺毛不分泌物质，但可以阻碍草食动物的侵害，如拟南芥。腺毛可作为次生代谢产物贮存的器官，也可保护植物免受昆虫、病原体的侵害，防止机械损伤及其后激变，有利于植物适应不良环境。如能从分子水平上提高腺毛的含量，则可增加次生代谢产物的含量，提高药用成分，并对增加植物的抗逆性有极大的帮助。植物的气孔是植物体与外界进行气体交换的重要通道，其开张度与气孔导度直接影响植物的光合作用和蒸腾作用，气孔调节是水分胁迫下植物抵御干旱和适应环境的机制之一。气孔的分布特征、密度和面积等受到环境水分状况的影响。小而密的气孔同时也具有较高的灵活性，因此有利于植物保持体内水分和保证有效的呼吸作用，是植物适应旱生环境的表现。如能从分子水平上调节气孔的数量，则可增加植物的抗旱性，提高适应不良环境的能力。专利技术内容本专利技术的目的在于获得一种从突变体湘棉18中克隆的Ghexp基因，及其在培育转基因植物中的应用。从而使植物的腺毛发达，或者气孔密度增加适应不良环境的能力提高。一种棉花Ghexp基因包含一个开放阅读框，其核苷酸序列为SEQ ID NOl0该基因已注册于GenBank，登陆号为JN255197。一种重组质粒p3301_Ghexp的序列中含有SEQ ID N01。上述重组质粒p3301_Ghexp在培育Ghexp基因过表达的转基因植物中的应用。一种培育Ghexp基因过表达的转基因植物的方法，包括如下步骤 I)种植需要腺毛发达或气孔密度增加的植物。2)制备含重组质粒p3301_Ghexp的单克隆阳性农杆菌GV3101菌液 a)构建权利要求2所述的重组质粒p3301-Ghexp ；b)制备农杆菌GV3101细胞感受态； c)将步骤a)中的重组质粒和步骤b中的农杆菌GV3101细胞感受态按体积比1:20混匀，YEB培养基，28 °C摇培3 4h，得到单克隆阳性农杆菌GV3101菌液。3)将步骤I)处于花期中植物的花序浸入步骤2)获得的菌液中，浸染3 5min ；暗处培养24 h后恢复光照，培养植株至成熟，得到Ttl代种子；种植Ttl代种子，挑选潮霉素抗性植株，培养成熟得到T1代种子；种植T1代种子，挑选潮霉素抗性植株，培养成熟得到T2代种子；种植T2代种子，挑选抗性比为3:1的单插入独立株系，获得纯合T3代种子，及转基因植物。步骤I)中所述植物为次生代谢产物存于腺毛中的药用植物。本专利技术还提供了含有上述基因的转基因拟南芥纯系植株组成型过量表达该基因的转基因纯系植株。该植株比野生型根毛长，体表腺毛更多，叶片气孔密度增加。 本专利技术的有益效果是本专利技术克隆了一个促进腺毛生长的Ghexp基因，该基因可增加拟南芥植物体表腺毛数目及长度，并提高叶片气孔密度。将该基因进行转基因，对能产生次生代谢产物的植株可增加次生代谢产物的含量，提高药用成分，并对提高植物的抗逆性有极大的帮助。附图说明图I是Ghexp基因的PCR扩增结果 图2是Ghexp基因在不同时期的表达量变化示意 图3是Ghexp基因在T2代转基因拟南芥中的PCR鉴定结果 图4是野生型拟南芥与转基因拟南芥根长比较 图5是本专利技术T3代转基因拟南芥茎腺毛 图6是本专利技术野生型拟南芥茎腺毛 图7是本专利技术T3代转基因拟南芥叶腺毛 图8是本专利技术野生型拟南芥叶腺毛 图9是本专利技术T3代转基因拟南芥叶片腺毛电镜 图10是本专利技术野生型拟南芥叶片腺毛电镜 图11是本专利技术T3代转基因拟南芥叶片气孔电镜 图12是本专利技术野生型拟南芥叶片气孔电镜图。具体实施例方式实施例I Ghexp基因全长cDNA序列的克降和序列测定 根据黄瓜基因序列(NCBI No. AC007292. I)，利用Premier 5. O软件设计基因特异性引物，引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。上游引物5' -AAGCTTGAACGGTGCGGACGT-3 ;，下游引物5 ; -GAATTCCTGATATAGATAGTCA-3 ;。Ghexp基因克隆湘棉18种子萌发至2-3cm，提取总RNA。以总RNA为模板，反转录合成cDNA第一链。具体反应体系和反应条件参照TaKaRa公司的RNA PCR试剂盒的使用说明。以cDNA单链为模板，反应条件95°C，5 min，I次循环；(92°C 30s, 53°C 30s, 72°C2min)30次循环，最后72°C延伸lOmin。经质量浓度I %琼脂糖电泳后，见图I。回收目的片段并连接PMD18-T载体，转化E. coliDH5 α，提取质粒，经限制性内切酶酶切鉴定正确后送交上海生物工程技术服务有限公司测序。测序结果见SEQ ID Nol0利用上述引物PCR扩增得到包含有Ghexp基因的基因片段，用该基因编码一个217个氨基酸残基组成的蛋白质,包含一个Rare lipoprotein A (稀有脂质A)和Pollenallergen (花粉变应原蛋白)的结合域。实施例2 Ghexp基因的表达量分析 I、材料分别取湘棉18腺毛形成前和腺毛形成后的胚轴，胚根，子叶作为提取材料。2、Trizol 法提取总 RNA I)将上述材料分别放入液氮预冷的研钵中，在液氮中充分研磨成粉末。2)待液氮挥发干，立即转移到2mL的离心管中，每IOOmg材料约加入ImL的Invitrogen公司的TRizol提取液，剧烈振荡混匀样品，使样品充分裂解，室温放置5分钟。3)加入O. 2mL氯仿(chloroform),剧烈振荡混勻15秒，室温放置10分钟。4)4。。，12000rpm 离心 15 分钟。5)用移液器吸出上层水相，加入到I. 5mL的新离心管中，再在该离心管中加入500 μ L的异丙醇，水相与异丙醇的体积比为1: 1，将两者充分混匀，在_20°C下，沉淀30min。6)在4°C , 12000rpm的转速下离心IOmin,弃去上清液。7)用ImL的75%乙醇洗涤RNA沉淀，在4°C，8000rpm的转速下离心lOmin，收集沉淀。8)重复用75%乙醇洗涤一次RNA沉淀。9)去上清，RNA沉淀于无菌操作台上晾干约10-15分钟，RNA略显透明，加入30 50 μ L的RNase-free水充分溶解(可放于-80°C长期保存)。10)用紫外分光光度法及l%Agr0Se凝胶电泳检测RNA浓度及质量。a)用紫外分光光度计检测RNA的产量，在260nm处的吸光度，根据在260nm和280nm处的吸光值，检测RNA的纯度本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种棉花Ghexp基因，其特征是：该基因的核苷酸序列为:？SEQ？ID？NO1。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：谢永芳，梁亦龙，曾垂省，蔡应繁，向浏欣，
申请(专利权)人：重庆邮电大学，
类型：发明
国别省市：