一种棉花脱水素蛋白及其编码基因与应用制造技术

一个来源于棉花的脱水素蛋白dehydrin09及其编码基因，以及其在培育抗旱性提高的转基因植物中的应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种棉花脱水素蛋白及其编码基因与应用
本专利技术涉及植物蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一个来源于棉花的脱水素蛋白dehydrin09及其编码基因，以及其在培育耐旱性提高的转基因植物中的应用。技术背景脱水素是LEA蛋白中的一类，广泛存在于植物的各个组织器官及植物胚胎发育后期。脱水素是植物在受低温、干旱和高盐等非生物逆境胁迫时合成的一类高亲水性保护蛋白，具有保护核酸、胞内蛋白和膜结构免受损害的功能。许多研究已经证实在非生物胁迫下，植物脱水素的表达与积累和植物抗逆性之间存在着紧密的联系。非生物胁迫，如干旱、盐渍、极端温度、化学污染和氧损伤等能够对植物的生长发育造成严重的危害，对作物产量造成极大损失，其中干旱对作物产量的影响，在诸多自然逆境中占首位，其危害相当于其它灾害之和，是许多地区是农业发展的瓶颈。据统计，世界干旱、半干旱地区占陆地面积的34％；我国干旱、半干旱地区约占国土面积的52％，年受旱面积达200～270万公顷，全国灌溉区每年缺水约30亿立方米，因缺水而少收粮食350～400亿公斤；特别是我国主要产粮区如华北、东北和西北，是我国缺水最严重的地区，春旱频繁达到十年九遇。由于植物的耐胁迫性大多属于数量性状，现有可利用的种质资源匮乏，采用常规育种技术改良植物胁迫耐性的难度相当大，培育出真正的耐胁迫品种就尤为困难。近年来，随着对植物抗逆分子机理研究的不断深入和分子生物学技术的迅猛发展，抗逆研究已经从生理水平深入到分子水平，促进了植物抗逆基因工程的发展。当植物在受到胁迫时会产生相应的应笞反应，来降低或消除给植株带来的危害。植物的这种应答反应是一个涉及多基因、多信号途径、多基因产物的复杂过程。这些基因及其表达产物可以分为3类：(1)参与信号级联放大系统和转录控制的基因及产物；(2)直接对保护生物膜和蛋白质起作用的基因及其表达产物；(3)与水和离子的摄入和转运相关的蛋白质。近年来，通过转基因技术提高植物对胁迫耐受能力的研究，以及对具有胁迫耐受能力的农作物、旱生植物和盐生植物的研究都取得了显著的成果，对胁迫相关基因和信号转导系统也有了更进一步的了解(LiuQ.1998.Twotranscriptionfactors，DREB1andDREB2，withanEREBP/AP2DNAbindingdomain，separatetwocellularsignaltransductionpathwaysindroughtandlowtemperatureresponsivegeneexpression，respectively，inArabidopsis.PlantCell，10：1391-1406；KANGJY.2002.Arabidopsisbasicleucinezipperproteinsthatmediatestressresponsiveabscisicacidsignaling.PlantCell，14：343-357；ABEH.2003.ArabidopsisAtMYC2(bHLH)andAtMYB2(MYB)functionastranscriptionalactivatorsinabscisicacidsignaling.PlantCell，15：63-78.)。但就目前的研究状况而言，由于其机制十分复杂，许多植物对逆境的生物化学和生理学上的响应机制仍有待深入研究。在抗逆应答基因的功能及表达调控方面的研究将为抗逆相关的信号传递途径之间的联系以及整个信号传递网络系统的研究提供重要的基础。
技术实现思路
本专利技术人利用SSH(抑制差减杂交)与RACE(cDNA末端快速扩增)相结合的方法克隆了棉花的一个脱水素蛋白(本文命名为dehydrin09)的编码基因，并测定了其DNA序列。并发现将其导入受体植株并超量表达后，可显著改善受体植株的耐旱性，而且这些性状可稳定遗传。本专利技术第一方面提供棉花的一个脱水素蛋白dehydrin09的编码基因(本文将其命名为Ghdehydrin09)，其核苷酸序列为SEQIDNO：2。本专利技术第二方面提供一种重组表达载体，其含有本专利技术第一方面所述的基因，其是通过将所述基因插入到一种表达载体而获得的，其中所述基因的核苷酸序列与所述重组表达载体的表达控制序列可操作地连接；优选地，所述表达载体是pCAMBIA2300；优选地，所述重组表达载体为附图2所示的rd29A-Ghdehydrin09-2300载体。本专利技术第三方面提供一种重组细胞，其含有本专利技术第一方面所述的基因或者本专利技术第二方面所述的重组表达载体；优选地，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。本专利技术第四方面提供一种改善植物耐旱性的方法，包括：将本专利技术第一方面所述的基因或者本专利技术第二方面所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达；优选地，所述植物是烟草。本专利技术第五方面提供一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有本专利技术第一方面所述的基因或者本专利技术第二方面所述的重组表达载体的植物或植物组织；优选地，所述植物是烟草。本专利技术第六方面提供本专利技术第一方面所述的基因、本专利技术第二方面所述的重组表达载体或者本专利技术第三方面所述的重组细胞用于改善植物耐旱性以及用于植物育种的用途；优选地，所述植物是烟草。本专利技术第七方面提供由本专利技术第一方面所述的基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。附图说明图1是Ghdehydrin09基因的植物表达载体(rd29A-Ghdehydrin09-2300)的构建流程(图1a-1b)。图2是Ghdehydrin09基因的植物表达载体(rd29A-Ghdehydrin09-2300)的质粒图。图3是Ghdehydrin09基因的T0代转基因烟草植株(中图，T06；右图，T09)和作为对照的非转基因烟草植株(左图，CK)的耐旱模拟实验(转化芽移栽15天后的幼苗，干旱14天(不浇水)，25℃、10小时光培养/14小时暗培养循环)结果。图4是利用反转录PCR对T0代转基因烟草植株和非转基因对照植株中Ghdehydrin09基因在转录水平上的分子检测的验证结果。M为Marker，1-3为非转基因对照烟草植株，4-6为耐旱效果不显著的转基因烟草T0代植株，7-14为耐旱效果显著的转基因烟草T0代植株。具体实施方式下面结合非限制性实施例对本专利技术进行进一步说明。下面实施例中提到的未注明来源的限制性内切酶均购自NewEnglandBiolabs公司。实施例1干旱胁迫下棉花SSH文库构建：具体方法为：按照Clontech公司的PCR-selectTMcDNASubtractionKit试剂盒说明书所示的方法通过抑制差减杂交方法构建SSH文库(差减文库)。在实验过程中以干旱处理的棉花幼苗的叶片的mRNA作为样本(Tester)，以未处理的棉花幼苗的叶片的mRNA作为对照(Driver)。具体步骤如下：(1)供试材料：冀棉14(国家棉花中期库，获取单位中国棉花研究所，统一编号：ZM-30270)播种到灭过菌的蛭石上，在25℃、光照培养(光周期16h光照/8h黑暗)，每周浇1/2MS液体培养基(含9.39mMKNO3，0.625mMKH2PO4，10.3mMNH4NO3，0.75mMMgSO4，1.5mM本文档来自技高网...

【技术保护点】
PCT国内申请，权利要求书已公开。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.棉花的一个脱水素蛋白，其序列为SEQIDNO：1。2.编码权利要求1的脱水素蛋白的基因，其序列为SEQIDNO：2。3.一种重组表达载体，其是通过将权利要求2所述的基因插入到一种表达载体而获得的，并且所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接，所述表达载体是pCAMBIA2300。4.权利要求3所述的重组表达载体，其为附图2所示的rd29A-Ghdehydrin09-2300载体。5.一种重组细胞，其含有权利要求2所述的基因或者权利要求3或4所述的重组表达载体...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈文华，孙超，何云蔚，崔洪志，
申请(专利权)人：创世纪种业有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44