用于转基因的种子特异性表达的棉花α－球蛋白启动子制造技术

本发明专利技术涉及棉花种子特异性基因α－球蛋白的５′调控区。当所述５′调控区或其部分可操作地连接于天然基因、异源基因的编码序列或者植物种子中的序列或互补序列时，该调控区可用在表达盒及表达载体中用于转化植物。同样提供的还有通过用本表达盒及表达载体转化植物来调节天然或异源基因例如脂肪酸合成或脂类代谢基因水平的方法。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
专利技术人Keerti S.Rathore，Ganesan Sunilkumar，JamesP.Connell和Avutu S.Reddy专利
本专利技术属于转基因表达的领域。更具体地，本专利技术属于用于植物转基因表达的基因转录启动子元件领域。
技术介绍
种子特异性转基因表达是许多使用遗传工程的应用所必需的。这些应用包括通过操纵经由代谢途径的通量改善种子营养品质的转基因方法(Hitz等，1995；Kinney，1996；Shintani和DellaPenna，1998；Goto等，1999)以及在便利的包装即种子中生产具有工业或药用价值的新化合物(Cahoon等，2000)。这些转基因特征中某些可能需要在发育种子中表达不止一个转基因(Ye等，2000)。在其它情况下，改善种子品质的代谢工程可能需要在种子发育期间过表达和/或抑制多种基因。根据过表达或抑制的期望程度，每一步都将需要合适强度的启动子。另外，可能也需要具有合适的发育定时(developmental timing)的启动子。即使需要相同程度地表达不止一个基因，为多个引入的基因使用相同的启动子也是不明智的。在转基因高拷贝数整合的某些情况下，启动子同源性可导致基因沉默(Vaucheret，1993；Brusslan和Tobin，1995；Park等，1996)。种子储藏蛋白在种子发育期间高水平表达，且它们在发育种子中的表达在空间上和时间上都被紧密地调控。因此，来自编码种子储藏蛋白的基因的调控序列代表了能够用于驱动转基因以种子特异性方式表达的启动子的有价值的来源。来自大豆β-conglycinin基因(Barker等，1988；Chen等，1988；Lessard等，1993)、法国菜豆菜豆蛋白基因(Bustos等，1989，1991；Kawagoe等，1994)、向日葵半日花素(helianthinin)基因(Bogue等，1990；Nunberg等，1995)的启动子以及胡萝卜Dc3启动子(Seffens等，1990；Kim等，1997)是来自双子叶植物的某些充分描述特征的种子特异性启动子的实例。尽管可获得此类系列的其它启动子，表达水平和基因沉默的问题依然是一个问题。因而，来自不止一个来源的长度不等的启动子的需求渐增，以满足将来调控种子中一种或多种转基因表达的需要。专利技术概述响应植物转基因领域对新启动子元件的持续需要，自棉花α-球蛋白基因分离了1144bp的5′调控区，包括1108bp的启动子序列和36bp的5′转录非翻译序列，并在功能上进行了特征描述。球蛋白是棉花主要的种子储藏蛋白，并在种子成熟期时构成总蛋白的大约60％(Dure，1989)。在棉花中，存在两个α-球蛋白基因，基因A和基因B，分别编码分子量为48和51kDa的蛋白(Chlan等，1987)。本专利技术利用α-球蛋白基因启动子根据本文公开的教导提供植物中转基因的表达。本说明书中共开的α-球蛋白基因启动子解决了植物转基因领域对新启动子元件的持续需求。在至少一个实施方案中，所述转基因表达如本文公开的教导所定义的那样是种子特异性的。在一个实施方案中，所述转基因表达利用含1108bp α-球蛋白基因启动子序列的启动子DNA实施。在不同的实施方案中，所述转基因表达利用包含不干扰所述1108bp序列的启动子功能的附加序列的启动子DNA。又在另一个实施方案中，所述转基因表达利用仅含部分所述1108bp序列分启动子DNA，从而在种子和植物发育期间，该部分序列的启动子功能能力在功能上类似于全长的1108bp序列。在一个实施方案中，利用α-球蛋白基因启动子驱动编码多肽的RNA转录以在种子中表达。在另一实施方案中，所述RNA编码具有商业价值的多肽，例如酶、抗体和疫苗多肽。又在另一个实施方案中，α-球蛋白基因启动子导致阻碍种子发芽的蛋白表达。在另一实施方案中，α-球蛋白基因启动子导致改善种子营养品质的多肽的RNA转录。在另一个实施方案中，α-球蛋白基因启动子驱动具有目的特性的RNA如反义RNA或核酶转录。在一个特别的实施方案中，所述反义RNA与编码参与毒素即棉花中表达的棉酚(Gossypol)生物合成的酶的RNA互补。在另一个实施方案中，所述反义RNA与一个或多个参与脂肪酸合成的酶的RNA互补。在一个有利的实施方案中，此类RNA能够靶向病毒基因组或转录本以预防或减轻疾病。在另一个有利的实施方案中，此类RNA能够靶向并调控内源转录本的表达。在另一个实施方案中，α-球蛋白启动子驱动其转录本将形成发夹结构的DNA序列转录，所述发夹结构通过RNA干预介导天然基因的转录后基因沉默。在不同的实施方案中，α-球蛋白基因启动子导致编码内源蛋白的RNA转录，以通过共阻遏机制沉默所述蛋白的基因(美国专利No.6,100,450；12栏，42-60行)。又在另一个实施方案中，α-球蛋白基因启动子驱动调控双子叶植物种子脂肪酸含量的转录本表达。附图的简短说明参照附图中举例说明的且在文中描述的实施方案，将对上文简要概述的专利技术进行更加详细的描述。不过，应当指出，所述附图仅仅阐释了本专利技术的某些实施方案，因而不应当认为限制了其范围，因为本专利技术可允许其它等同有效的实施方案。附图说明图1显示了α-球蛋白启动子的序列和报告基因构建体。A.启动子区的核苷酸序列。B.本专利技术实施方案中所用的双元载体pBIAGPGUS的T-DNA。图2显示了在来自稳定转化的烟草、棉花和拟南芥属植物以及发芽的拟南芥属幼苗的发育中胚中的GUS活性的组织化学分布。A-E.来自T1-纯合的烟草植物的胚中的活性A.开花后9天(dpa)的胚，B.10dpa的胚，C.13dpa的胚，D.17dpa的胚，E.来自干种子的成熟胚；F-N.来自T1-纯合的棉花植物的胚中的GUS活性F.显示初始GUS活性的16dpa胚的高放大倍数图像，G.较低放大倍数下的相同胚，H.18dpa的胚，I.19dpa的胚，J.20dpa的胚，K.25dpa的胚，L.30dpa的胚，M.40dpa的胚，N.显示胚根和下胚轴区染色的分离自干种子且从中间切开的胚；O.来自零分离(null seqregant)棉花种子的胚；P-T拟南芥(Arabidopsis thalia)种子中的GUS活性P.鱼雷期胚(4dpa)，Q.手杖期胚(5dpa)，R.反转的U期胚(7dpa)，S.部分成熟的胚(9dpa)，T.来自干种子的成熟胚；U-Y转基因拟南芥属种子发芽期间的GUS活性U.分离自干种子的胚，V.1天龄幼苗，W.3天龄幼苗，X.5天龄幼苗，Y.8天龄幼苗。尺度A-E，P-T＝100μm；F-O，U-Y＝1mm。图3显示了烟草中α-球蛋白启动子对GUS表达的发育调控。A.烟草种子中α-球蛋白启动子对GUS表达的发育调控。B.在吸涨(imbibition)后不同天数的发芽期间烟草幼苗中的GUS特异性活性。图4显示了棉花胚中α-球蛋白启动子对GUS表达的发育调控。来自发育中棉花胚的提取物中的GUS特异性活性(实心圆)和总蛋白(空心圆)作为开花后天数(dpa)的函数。图5显示了来自独立转基因世系的T0烟草、T1拟南芥和T0棉花种子中的GUS活性。图6显示了分离自T1纯合子种子以及单T1半合子棉花植物种子的单个胚中的GUS特异性活本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离的核酸，对应于指导种子特异性表达的ＡＧ５′调控区，包含ＳＥＱＩＤＮＯ：１中所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：KS拉瑟尔，G苏尼库玛，JP康奈尔，AS雷迪，
申请(专利权)人：得克萨斯州AM大学系统，
类型：发明
国别省市：US[美国]