提高基因组编辑效率的方法技术

本发明专利技术涉及一种提高基因组编辑效率的方法，所述方法包括向宿主细胞中引入增效因子，所述增效因子具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明专利技术提供了一些新的增效因子，能够显著提高细胞内同源重组概率，当本发明专利技术所述增效因子在与分子剪刀共同使用时，可以显著提升分子剪刀的切割效率，进而提升基因组编辑的效率。

【技术实现步骤摘要】
提高基因组编辑效率的方法
本专利技术提供一种提高基因组编辑效率的方法，特别是涉及一种新的能够显著提高同源重组概率的增效因子，将所述增效因子与基因组编辑系统结合可提高基因组编辑效率。
技术介绍
在CRISPR/Cas9基因编辑系统中，设计不同的sgRNA足以指导Cas9内切酶完成对DNA的定点切割，形成DNA双链断裂(DSB)，进而启动细胞自身的两种修复机制——非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HR)，实现错误修复或者引入改变，造成DNA序列改变，从而实现基因的定向修饰操作。DNA断裂产生后，当细胞内不存在同源片段时，细胞会启动非同源末端连接修复机制，在切口附近随机缺失或插入碱基，连接断裂的DNA双链。当细胞内存在同源片段时，细胞会发生极低概率的同源重组；如单链退火(SSA)是细胞内同源重组的一种常见方式。CRISPR/Cas9系统是通过同源重组修复机制实现目标基因中不同类型的修饰，包括基因的删除、添加和替换等。当CRISPR/Cas9系统应用于植物时，即使存在外源引入的同源片段，植物体内发生同源重组的概率依然很低，这成为限制基因组编辑效率的瓶颈，所以提高同源重组概率对于基因组编辑系统的优化具有重要的意义。目前，提高同源重组概率主要有以下途径：1)抑制非同源末端连接；实验表明，若抑制非同源末端连接途径中的相关蛋白如Ku70、Ku80、Lig4等的表达，会提高同源重组的概率。2)引入增效因子；已报道在拟南芥中引入酵母的Rad54基因(ScRad54)，能够使同源重组概率提高约27倍，但目前没有其他有效的增效因子。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种提高基因组编辑效率的方法，有效克服了现有技术在植物体内发生同源重组概率低进而影响精确编辑的技术缺陷。为实现上述目的，本专利技术提供一种提高同源重组概率的方法，包括向宿主细胞中引入增效因子，所述增效因子具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。进一步地，所述增效因子包含a)或b)：a)编码SEQIDNO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸序列；b)SEQIDNO:2所示的多核苷酸序列。进一步地，编码所述增效因子的多核苷酸序列有效连接于第一调控序列。更进一步地，所述第一调控序列包括Ⅱ型启动子和/或定位结构域。优选地，所述Ⅱ型启动子包括花椰菜花叶病毒35S启动子或泛素启动子。在上述技术方案的基础上，所述方法还包括向宿主细胞中引入序列操纵系统。具体地，所述序列操纵系统为CRISPR/Cas系统。进一步地，编码所述基因组编辑系统的多核苷酸序列有效连接于第二调控序列。更进一步地，所述第二调控序列包括Ⅲ型启动子。优选地，所述Ⅲ型启动子包括U6启动子或U3启动子。在上述技术方案的基础上，所述宿主细胞为植物细胞。为实现上述目的，本专利技术还提供一种基因组编辑系统，包括包含a)和b)：a)编码增效因子的多核苷酸序列；b)编码序列操纵系统的多核苷酸序列；其中，所述增效因子具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。可选地，所述增效因子与所述序列操纵系统由不同载体表达。可选地，所述增效因子与所述序列操纵系统由同一载体表达。进一步地，所述增效因子包含a)或b)：a)编码SEQIDNO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸序列；b)SEQIDNO:2所示的多核苷酸序列。进一步地，编码所述增效因子的多核苷酸序列有效连接于第一调控序列。更进一步地，所述第一调控序列包括Ⅱ型启动子和/或定位结构域。优选地，所述Ⅱ型启动子包括花椰菜花叶病毒35S启动子或泛素启动子。在上述技术方案的基础上，所述序列操纵系统为CRISPR/Cas系统。进一步地，编码所述CRISPR/Cas系统的多核苷酸序列有效连接于第二调控序列。更进一步地，所述第二调控序列包括Ⅲ型启动子。优选地，所述Ⅲ型启动子包括U6启动子或U3启动子。为实现上述目的，本专利技术还提供一种提高基因组编辑效率的方法，包括向宿主细胞中引入所述基因组编辑系统。进一步地，所述宿主细胞为植物细胞。为实现上述目的，本专利技术还提供一种实现高效基因组编辑的方法，包括在生物体中表达所述基因组编辑系统。为实现上述目的，本专利技术还提供一种高效编辑靶位点序列的方法，包括将所述基因组编辑系统导入生物体中。为实现上述目的，本专利技术还提供一种产生基因组编辑的植物的方法，包括向植物基因组中引入编码所述基因组编辑系统的核苷酸序列。为实现上述目的，本专利技术还提供一种产生基因组编辑植物种子的方法，包括将所述方法产生的基因组编辑的植物自交，从而获得具有基因组编辑植物种子。为实现上述目的，本专利技术还提供一种培育基因组编辑植物的方法，包括：种植至少一粒所述方法产生的所述基因组编辑植物种子；使所述种子长成植株。为实现上述目的，本专利技术还提供一种增效因子在提高同源重组概率中的用途，其中，所述增效因子具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。为实现上述目的，本专利技术还提供一种所述基因组编辑系统在提高同源重组概率和/或提高基因组编辑效率中的用途。本专利技术中所述的CRISPR(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats)，是指成簇的规律间隔的短回文重复序列，含有多个短同向重复的基因座，其被发现存在于约40％测序细菌的基因组中和90％测序古细菌的基因组中。CRISPR作为原核的免疫系统发挥功能，其赋予对外来遗传元件例如质粒和噬菌体的抵抗性。CRISPR系统提供了一种获得性免疫形式。外源DNA的短片段(称为间隔区)整合在CRISPR重复序列之间的基因组中，然后CRISPR间隔区以类似于真核生物中RNAi的方式用于识别和沉默外来遗传元件。本专利技术所述Cas蛋白的非限制性实例包括：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8，Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、其同系物、或其修饰形式。这些酶是已知的；例如，化脓链球菌Cas9蛋白的氨基酸序列可见于SwissProt数据库登录号Q99ZW2下。在一些实施例中，未修饰的CRISPR酶如Cas9具有DNA切割活性。在一些实施例中，该CRISPR酶是Cas9，并且可以是来自化脓链球菌或肺炎链球菌的Cas9。本专利技术中所述的Cas9，Ⅱ型CRISPR/Cas系统中一种重要的蛋白质成分，可以从生物体如链球菌属物种(Streptococcussp.)，优选酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)中分离得到。当Cas9与称为CRISPRRNA(crRNA)和反式激活crRNA(TracrRNA)的两个RNA复合时，形成活性核酸内切酶，从而切断入侵噬菌体或质粒中的外源遗传元件，以保护宿主细胞。crRNA从宿主基因组中的CRISPR元件转录，其中该CRISPR元件之前自外源入侵物捕获本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高同源重组概率的方法，其特征在于，包括向宿主细胞中引入增效因子，所述增效因子具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种提高同源重组概率的方法，其特征在于，包括向宿主细胞中引入增效因子，所述增效因子具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。2.根据权利要求1所述提高同源重组概率的方法，其特征在于，所述增效因子包含a)或b)：a)编码SEQIDNO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸序列；b)SEQIDNO:2所示的多核苷酸序列。3.根据权利要求1或2所述提高同源重组概率的方法，其特征在于，编码所述增效因子的多核苷酸序列有效连接于第一调控序列。4.根据权利要求3所述提高同源重组概率的方法，其特征在于，所述第一调控序列包括Ⅱ型启动子和/或定位结构域。5.根据权利要求4所述提高同源重组概率的方法，其特征在于，所述Ⅱ型启动子包括花椰菜花叶病毒35S启动子或泛素启动子。6.根据权利要求1-5任一项所述提高同源重组概率的方法，其特征在于，所述方法还包括向宿主细胞中引入基因组编辑系统。7.根据权利要求6所述提高同源重组概率的方法，其特征在于，所述基因组编辑系统为CRISPR/Cas系统。8.根据权利要求6或7所述提高同源重组概率的方法，其特征在于，编码所述基因组编辑系统的多核苷酸序列有效连接于第二调控序列。9.根据权利要求8所述提高同源重组概率的方法，其特征在于，所述第二调控序列包括Ⅲ型启动子。10.根据权利要求9所述提高同源重组概率的方法，其特征在于，所述Ⅲ型启动子包括U6启动子或U3启动子。11.根据权利要求1-10任一项所述提高同源重组概率的方法，其特征在于，所述宿主细胞为植物细胞。12.一种基因组编辑系统，其特征在于，包含a)和b)：a)编码增效因子的多核苷酸序列；b)编码序列操纵系统的多核苷酸序列；其中，所述增效因子具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。13.根据权利要求12所述基因组编辑系统，其特征在于，所述增效因子与所述序列操纵系统由不同载体表达。14.根据权利要求12所述基因组编辑系统，其特征在于，所述增效因子与所述序列操纵系统由同一载体表达。15.根据权利要求12-14任一项所述基因组编辑系统，其特征在于，所述增效因子包含a)或b)：a)编码SEQIDNO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的多核...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨进孝，徐雯，张成伟，
申请(专利权)人：北京大北农生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11