一种可提高加A效率的突变型Taq酶及其制备方法和应用技术

一种可提高加A效率的突变型Taq酶及其制备方法和应用，具体是将野生型Taq酶进行定向突变，使第315位的谷氨酸突变为赖氨酸，第388位的谷氨酸突变为缬氨酸，第507位的谷氨酸突变为赖氨酸，第578位的天冬氨酸突变为甘氨酸，第608位的丙氨酸突变为缬氨酸，第747位的甲硫氨酸突变为精氨酸，得到氨基酸序列如SEQ NO.1所示的突变型Taq酶。该突变型Taq酶的加A效率得到提升，增加了建库效率，可应用于更低起始量模板、增加建库完整性和覆盖度。

【技术实现步骤摘要】
一种可提高加A效率的突变型Taq酶及其制备方法和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种可提高加A效率的突变型Taq酶及其制备方法和应用。
技术介绍
DNA聚合酶是一类以单链DNA为模板，合成其互补链的酶类。和其他来源于自然环境中的酶一样，DNA聚合酶在进化中已经适应了其发挥功能的环境，有相应的最适反应条件。不同来源的DNA聚合酶有不同的性质和功能，除聚合酶活性外，绝大多数也都包含外切酶活性(3’-5’外切酶活性或5’-3’外切酶活性)，其中最常用的是来自一种水生嗜热菌(Thermusaquaticus)的耐热Taq酶。TaqDNA聚合酶属于DNA聚合酶I家族，具有聚合酶和5’-3’外切酶活性，其聚合产物通常会在3’端形成一个带A的粘性末端。目前的研究已经对Taq酶的各方面性质有了比较明确的认识。在实际应用中，除野生型Taq酶外，也对野生型Taq酶做了不同的突变以优化其各方面的性能。目前，现有技术中有对TaqDNA聚合酶做突变或融合某些DNA结合蛋白来改善Taq酶的某些方面性能，比如热稳定性、延伸速度、延伸长度等。在目前高速发展的高通量测序技术应用中，Taq酶也被用来在建库过程中给短的DNA片段末端加A，以利于后续加接头等操作。除了野生型Taq酶之外，用于加A的酶还可以是DNA结合蛋白修饰过的Taq酶、3’-5’外切酶活性缺失的klenow酶、5’-3’外切酶活性缺失的Taq酶等。由于目前已有的用于加A的酶普遍存在效率较低的情况，不能有效加A导致接头无法连接到DNA片段上，所以，大大限制了高通量测序中建库的质量和效率。因此，需要对野生型Taq酶进行改造，使之适应目前高通量测序技术的建库需求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可提高加A效率的突变型Taq酶及其制备方法和应用，克服了现有高通量测序技术中DNA片段末端加A效率低的缺陷，改造得到氨基酸序列如SEQNO.1所示的突变型Taq酶，此突变型Taq酶加A效率得到较大提高，更加适应高通量测序建库的需求。为达到上述目的，本专利技术的技术方案是：一种可提高加A效率的突变型Taq酶，含有下述1-6个突变位点：突变位点1：E315K，即野生型Taq酶氨基酸序列中第315位的谷氨酸突变为赖氨酸；突变位点2：E388V，即野生型Taq酶氨基酸序列中第388位的谷氨酸突变为缬氨酸；突变位点3：E507K，即野生型Taq酶氨基酸序列中第507位的谷氨酸突变为赖氨酸；突变位点4：D578G，即野生型Taq酶氨基酸序列中第578位的天冬氨酸突变为甘氨酸；突变位点5：A608V，即野生型Taq酶氨基酸序列中第608位的丙氨酸突变为缬氨酸；突变位点6：M747R，即野生型Taq酶氨基酸序列中第747位的甲硫氨酸突变为精氨酸。本专利技术所述可提高加A效率的突变型Taq酶，其氨基酸序列如SEQNO.1所示。本专利技术还提供编码所述突变型Taq酶的基因。进一步，本专利技术编码所述突变型Taq酶的基因的核苷酸序列如SEQNO.2所示。需要说明的是，由于同一氨基酸可能有多种不同的密码子来决定，所以编码上述突变型Taq酶的核苷酸序列并不局限于SEQNO.2所示序列，也可以是由与SEQNO.2所示核苷酸序列突变一个或几个核苷酸形成同义突变得到可编码相同氨基酸序列的核苷酸序列。再，本申请提供了一种载体，该载体包含可编码所述突变型Taq酶的核苷酸序列。进一步，所述载体包含如SEQNO.2所示的核苷酸序列。一种重组细胞，包含：包含可编码所述突变型Taq酶的核苷酸序列，或包含可编码所述突变型Taq酶的核苷酸序列的载体。进一步，所述重组细胞所使用的宿主细胞为BL21。一种含有所述突变型Taq酶的聚合酶试剂。本专利技术所述突变型Taq酶在高通量测序中的应用。本专利技术所述可提高加A效率的突变型Taq酶的制备方法，其包括如下步骤：1)构建含编码突变型Taq酶的核苷酸序列的载体：利用含有突变位点信息的引物，对含有野生型Taq酶基因的质粒进行PCR扩增；得到目的条带后利用同源重组得到重组质粒或直接转化得到突变质粒，测序验证；2)将步骤1)得到的载体转化宿主细胞得到重组细胞：将载体转化到宿主细胞中，利用抗生素筛选得到正确转化的重组细胞；3)培养并收集重组细胞，提取纯化突变型Taq酶。进一步，步骤1)中，所述引物的具体序列如下：E315K-1：TTCCCGCAAGAAGCCCATGTGGGCCGATCTTCTG；E315K-2：CCCACATGGGCTTCTTGCGGGAAAGCACAAAGCC；E388V-1：CACCACCCCCGTGGGGGTGGCCCGGCGCTACGGC；E388V-2：GGGCCACCCCCACGGGGGTGGTGTTGGAAGGGTC；E507K-1：CGGCAAGACGAAGAAGACCGGCAAGCGCTCCACC；E507K-2：TGCCGGTCTTCTTCGTCTTGCCGATGGCGGGAAG；D578G-1：AAGTAGCTCCGGCCCCAACCTCCAGAACATCCCC；D578G-2：GGAGGTTGGGGCCGGAGCTACTTAGCCTGCCCGT；A608V-1：GCTATTGGTGGTGCTGGACTATAGCCAGATAGAG：A608V-2：TATAGTCCAGCACCACCAATAGCCACCCCTCCTC；M747R-1：GGCCGAGCGCCGCGCCTTCAACATGCCCGTCCAGG；M747R-2：TGTTGAAGGCGCGGCGCTCGGCCGCCTCCCGCAC。本专利技术上述引物中包含了需要突变的位点和替换过的碱基。本专利技术测试结果显示：与野生型Taq酶相比，使用本专利技术改造的所述突变型Taq酶进行加A的实验组文库产量明显提高，文库分布无异常，充分说明所述突变型Taq酶的加A效果得到显著提高。本专利技术的有益效果：本专利技术对野生型Taq酶进行定向突变优化，使之适应在高通量测序技术中的应用要求，得到所述突变型Taq酶。该突变型Taq酶使加A效率得到提升，增加了建库效率，可应用于更低起始量模板和增加建库完整性和覆盖度。附图说明图1为本专利技术实施例4文库的琼脂糖凝聚电泳检测结果。图2为本专利技术实施例4文库分布检测结果。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步说明。实施例1构建含编码突变型Taq酶的核苷酸序列的载体利用基因合成的方法，合成引物序列如下：E315K-1：TTCCCGCAAGAAGCCCATGTGGGCCGATCTTCTG；E315K-2：CCCACATGGGCTTCTTGCGGGAAAGCACAAAGCC；E388V-1：CACCACCCCCGTGGGGGTGGCCCGGCGCTACGGC；E388V-2：GGGCCACCCCCACGGGGGTGGTGTTGGAAGGGTC；E507K-1：CGGCAAGACGAAGAAGACCGGCAAGCGCTCCACC；E507K-2：TGCCGGTCTTCTTCGTCTTGCCGATGGCGGGAAG；D578G-1：AAGTAGCTCCGGCCCCAACCTCCAGAACATCCCC；D578G-2：GGAGGTTGGGGCCGGAGCTACTTAGCCTGCCCGT；A608V-1：GCTATT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可提高加A效率的突变型Taq酶，其特征在于，所述突变型Taq酶含有下述1‑6个突变位点：突变位点1：E315K，即野生型Taq酶氨基酸序列中第315位的谷氨酸突变为赖氨酸；突变位点2：E388V，即野生型Taq酶氨基酸序列中第388位的谷氨酸突变为缬氨酸；突变位点3：E507K，即野生型Taq酶氨基酸序列中第507位的谷氨酸突变为赖氨酸；突变位点4：D578G，即野生型Taq酶氨基酸序列中第578位的天冬氨酸突变为甘氨酸；突变位点5：A608V，即野生型Taq酶氨基酸序列中第608位的丙氨酸突变为缬氨酸；突变位点6：M747R，即野生型Taq酶氨基酸序列中第747位的甲硫氨酸突变为精氨酸。

【技术特征摘要】
1.一种可提高加A效率的突变型Taq酶，其特征在于，所述突变型Taq酶含有下述1-6个突变位点：突变位点1：E315K，即野生型Taq酶氨基酸序列中第315位的谷氨酸突变为赖氨酸；突变位点2：E388V，即野生型Taq酶氨基酸序列中第388位的谷氨酸突变为缬氨酸；突变位点3：E507K，即野生型Taq酶氨基酸序列中第507位的谷氨酸突变为赖氨酸；突变位点4：D578G，即野生型Taq酶氨基酸序列中第578位的天冬氨酸突变为甘氨酸；突变位点5：A608V，即野生型Taq酶氨基酸序列中第608位的丙氨酸突变为缬氨酸；突变位点6：M747R，即野生型Taq酶氨基酸序列中第747位的甲硫氨酸突变为精氨酸。2.根据权利要求1所述可提高加A效率的突变型Taq酶，其特征在于，所述突变型Taq酶的氨基酸序列如SEQNO.1所示。3.编码权利要求1或2所述突变型Taq酶的基因。4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQNO.2所示。5.含有权利要求3或4所述的编码所述突变型Taq酶的基因的载体。6.一种重组细胞，其特征在于，包含：权利要求3或4所述的基因，或，权利要求5所述的载体。7.一种含有权利要求1或2所述的突变型Taq酶的聚合酶试剂。8.如权利要求1或2所述的突变型Taq酶在高通量测序中的应用。9.如权利要求1或2所述的突变型Taq酶的制备方法，其包括如下步骤：1)构建含编码权利要求1或2所述突变型Taq酶的核苷酸序列的载体：利用含有突变位点信息的引物，对含有野生型Taq酶基因的质粒进行PCR扩增，得到目的条带后利...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹林，张力军，聂俊伟，韩锦雄，齐心，瞿志鹏，张晨曦，徐晓昱，
申请(专利权)人：南京诺唯赞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32