本发明专利技术公开了一种无背景定向克隆PCR产物载体及制备方法和应用，其特征是在载体筛选标记基因前引入XcmI盒，该XcmI盒的特征在于XcmI酶切后形成突出的dT末端，且序列拼接后将在筛选标记基因前形成一个无活性的核糖体结合位点，载体自连时筛选标记基因不能表达。本发明专利技术制备的载体经XcmI酶切后形成突出dT末端可以应用于TA克隆，dT末端也可以通过T4DNA聚合酶补平形成平末端，应用于平末端连接，方法易行，成本低廉，在两种克隆方法中的应用均可以达到无背景、定向克隆的效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属基因工程
，具体涉及一种可无背景定向克隆PCR产物的载体，还涉及一种可无背景定向克隆PCR产物载体的制备方法，同时还涉及一种可无背景定向克隆PCR产物载体的应用。
技术介绍
PCR(polymerase chain reaction)是分子生物学中的常规的实验技术,大部分基因功能探讨等都需要将目的片段通过PCR扩增出来然后克隆到相应的载体来进行研究。目前克隆PCR产物的方法有很多种，包括传统的酶切连接技术，新开发的不依赖酶切的Gateway 系统,不依赖于T4 DNA连接酶的Topo cloning ，以及不依赖于连接酶的克隆系统(ligation-independent cloning, LIC)等。尽管如此,在一些如cDNA文库构建，蛋白相互作用网络检测，转录调控网络研究等需要大规模构建克隆的工作中，前面提到的这些方法都具有各自的局限性。酶切连接的方法操作繁琐，且受限制性内切酶识别位点的限制，Gateway . 和Topo cloning⑧操作成本较高，LIC的方法依赖于10_15bp的单链DNA互补区，该区域通常容易形成二级结构从而影响克隆的效率。因此，最简单的方法还是将PCR产物直接与相应的载体进行连接。PCR产物直接连接载体常规方法就是采用TA克隆方案，利用Taq酶具有不依赖于模板的末端转移酶活性在PCR产物的3’端加上单个脱氧核苷酸A，然后在克隆载体上通过一定方法的处理(包括加dT尾和采用特异性内切酶等)获得突出dT，通过TA互补在T4DNA连接酶的作用下完成直接连接。利用此原理，现在已经开发了多种商业化的T载体，通过各种改造，目前研究者已经开发出不同筛选标记的T载体，以及高阳性率的T载体等，但由于目的片段两端都带有同样的dA尾，目的片段插入正反的筛选依然是目前存在的一个问题。虽然目前有通过给PCR产物引入特异性碱基，使之正向和反向插入到载体后与载体序列组合成不同限制性内切酶识别序列，通过将连接产物进行特异性内切酶处理可以较大程度上去除片段的插入正反，但增加了实验步骤，操作繁琐，特别是在大规模克隆过程中增加其工作量。另外一种PCR产物直接克隆的方法是平末端连接。由于Taq酶不具有3’ _5’外切酶活性，PCR过程中具有相对较高的错配率，在调取基因时一般都采用具有3’ -5’外切酶活性的高保真DNA聚合酶来扩增，由此得到的PCR产物不具有突出的A尾，只形成平末端产物。平末端产物的连接载体也必须是平末端，其载体自连是平末端连接过程中的一大困扰。载体去磷酸化等处理可以降低载体自连的概率，但由此PCR引物需要经过磷酸化处理，很大程度上增加了实验成本，由于载体去磷酸化效率的问题，克隆阳性率远不能达到100%，PCR产物平末端克隆插入正反的筛选也给大规模克隆增加了工作量。综上所述，虽然PCR产物的直接克隆在大规模克隆构建上具有操作简单等优势，但在克隆筛选上还需要很大程度上进行优化。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种PCR产物克隆载体，该载体可以达到无背景、定向克隆PCR产物的目的。本专利技术的另一个目的是在于提供了一种PCR产物克隆载体的制备方法，方法易行，成本低廉，为基因克隆特别是大规模克隆提供方法。本专利技术的再一个目的是在于提供了一种PCR产物克隆载体的应用，该载体既可以完成PCR产物的TA连接克隆，又可以完成平末端连接克隆，且在两种克隆方法中的应用均 可以达到无背景、定向克隆的效果。为了实现上述的目的，本专利技术采用以下技术措施本专利技术设计的克隆载体将PCR片段插入位点设计为抗性基因不具有活性的核糖体结合位点内部，克隆构建过程中通过PCR片段一段引入能与载体序列组合成有活性核糖体结合位点的方式来筛选正确的克隆，而载体自连和片段反向插入均造成筛选标记基因的核糖体结合位点不具有活性，从而达到无背景、定向克隆的目的。本专利技术的理论基础是位于基因起始密码子上游8±3bp的核糖体结合位点是原核基因的表达起始的重要元件，其序列由富含GA的核苷酸组成。不同基因前的核糖体结合位点序列不尽相同，但其序列GA含量直接影响基因表达效率。如核糖体结合位点序列由AGGAGA突变成TCCAGA时，基因则关闭表达。根据上述理论，在抗性基因起始密码子上游5bp处引入TCCAGA的不具有活性的核糖体结合位点，并在TCC-AGA中间引入PCR片段插入位点，将PCR片段5’端通过引物引入GGA、3’端通过引物引入AGG序列，由此PCR片段正向插入到载体后将形成AGGAGA有活性的核糖体结合位点，从而启动相应抗性基因的表达，而PCR片段反向插入或载体自连都将形成TCCAGA不具活性的核糖体结合位点，克隆在含有相应抗生素的平板上均不能生长，由此排除实验原因理论上可以达到PCR产物的无背景定向克隆。一种无背景定向克隆PCR产物的载体的制备方法，包括以下步骤I)包含无活性核糖体结合位点的抗性筛选基因的中间载体的制备以通用载体pUC18(TAKARA公司购买)为前体，用包含多克隆位点及无活性核糖体结合位点的筛选标记基因cat替换其中的IacZa片段，得到中间载体pBPl ;其具体步骤为a.利用特异性引物以PUC18载体为模板用高保真DNA聚合酶KOD-Plus-Neo扩增包括Amp抗性基因、复制子，Iac启动子元件的载体框架；扩增体系为10XPCR Buffer forKOD-Plus-Neo 5u l,2mM dNTPs 5u l,25mM MgSO4 3 y 1，10 y M 正向引物 I y 1，10 y M 反向引物lul，pUC18 DNA lOOng，超纯水加到最后体系为50 iil，最后加KOD-Plus-Neo IU ;正向引物SEQ ID No :2，反向引物SEQ ID No 3 ;利用PCR回收试剂盒纯化后得到载体框架片段，然后用识别片段两端限制性位点的内切酶BglII和KpnI对载体框架片段进行酶切，并回收相应片段；b.利用特异性引物以pACYC184质粒为模板用高保真DNA聚合酶KOD-Plus-Neo扩增 cat 基因的读码框；扩增体系为10XPCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5u l,2mM dNTPs5 u l,25mM MgSO4 3u 1，IOy M 正向引物 I u 1，IOy M 反向引物 I u l，pACYC184 DNA 100ng,超纯水加到最后体系为50 iil，最后加KOD-Plus-Neo 1U，正向引物SEQ ID No:4，反向引物SEQ ID No 5 ;利用PCR回收试剂盒纯化，利用识别cat基因的读码框两端的内切酶BglII和KpnI对片段进行酶切，并利用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切后的片段；c.将步骤a和步骤b获得的回收后的片段以摩尔比I : 3混合，在T4 DNA连接酶作用下形成闭合环状，后转入大肠杆菌DH5 a感受态细胞，用Amp筛选获得阳性克隆，从中提取质粒并测序鉴定，得到中间载体PBPl ；2) 一种无背景定向克隆PCR产物的载体的制备方法A.设计、合成XcmI盒人工合成XcmI盒,其特征包括5’端内切酶识别位点、5’端XcmI识别位点、Iac启动子，ccdB负筛选标记基因、3’端XcmI识别位点、3’端内切酶识别位点等，本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：胡杨波，冯立鹏，陈士云，
申请(专利权)人：中国科学院武汉病毒研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。