本发明专利技术揭示了一种WHV-S蛋白基因及基于该基因的零背景DNA克隆载体的构建方法，所述WHV-S蛋白基因的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO:1的核苷酸序列。本发明专利技术利用旱獭肝炎病毒（Woodchuckhepatitisvirus，WHV）表面S蛋白（WHV-S）对细菌的细胞毒性构建零背景（自杀）克隆载体，以降低DNA克隆时空载体发生率，节省克隆鉴定成本和时间，提高了工作效率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于遗传工程中DNA重组的载体
，尤其涉及一种WHV-S蛋白基因及基于该基因的零背景DNA克隆载体的构建方法。
技术介绍
目前，DNA分子克隆所用载体中，绝大部分采用的还是普通载体。1999年美国学者发现基因ccdB如果过量表达，具有杀伤大肠杆菌的作用。因而，近10多年来，形成了各种正性筛选克隆、表达载体，专利不下数十个，但是如果用Invitrogen公司的零背景(zerobackground)载体(含有自杀基因ccdB),不加外源DNA片段,直接用其pCR-1I blunt, zero载体自身连接，会发现有大量蓝斑菌落产生，这说明与LacZ α融合的ccdB蛋白的表达水平不足以杀伤实验室常用大肠杆菌菌株。
技术实现思路
鉴于上述现有技术存在的缺陷，本专利技术的目的是提出一种WHV-S蛋白基因及基于该基因的零背景DNA克隆载体的构建方法,利用旱獭肝炎病毒(Woodchuck hepatitisvirus, WHV)表面S蛋白(WHV-S)对细菌的细胞毒性构建零背景(自杀)克隆载体，以降低DNA克隆时空载体发生率，节省克隆鉴定成本和时间。本专利技术的目的将通过以下技术方案得以实现 一种WHV-S蛋白基因，所述WHV-S蛋白基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1的核苷酸序列，所述WHV-S蛋白基因可以与蓝斑相关蛋白LacZa基因融合表达。优选的，上述的一种WHV-S蛋白基因，其中所述WHV-S蛋白基因编码的WHV-S蛋白具有序列表中SEQ ID NO:2的氨基酸序列。优选的，上述的一种WHV-S蛋白基因，其中所述WHV-S蛋白基因编码全部或部分WHV-S蛋白序列、WHV-S蛋白的同源蛋白序列或者所述WHV-S蛋白序列和WHV-S蛋白的同源蛋白序列的缺失、突变或杂交序列。优选的，上述的一种WHV-S蛋白基因，其中所述WHV-S蛋白的同源蛋白序列或者所述WHV-S蛋白序列和WHV-S蛋白的同源蛋白序列的缺失、突变或杂交序列具有序列表中SEQ ID NO:3" SEQ ID NO:6 的氨基酸序列。优选的，上述的一种WHV-S蛋白基因，其中还包括一具有序列表中SEQ ID NO: 7的核昔酸序列的关键DNA序列，所述关键DNA序列编码的关键融合蛋白具有序列表中SEQID NO:8的氨基酸序列。一种基于上述的WHV-S蛋白基因的零背景DNA克隆载体，所述零背景DNA克隆载体包含或部分包含所述WHV-S蛋白基因DNA分子。一种基于上述的WHV-S蛋白基因的零背景DNA克隆载体的构建方法，包括以下步骤步骤I)将所述的WHV-S蛋白基因与目标克隆载体质粒进行扩增、酶切和拼接； 步骤2)将步骤I)所得产物转化大肠杆菌感受态细胞； 步骤3)挑取步骤2)所得的大肠杆菌进行克隆，克隆鉴定后，扩增重组正确的质粒DNA ；步骤4)提取质粒DNA，进行DNA测序分析，得到的阳性重组质粒即为零背景DNA克隆载体质粒。优选的，上述的零背景DNA克隆载体的构建方法，其中所述步骤I)具体包括以下步骤 步骤a)将野生型或人工合成的WHV-S蛋白基因进行PCR扩增，所述扩增的蛋白编码DNA至少包含WHV-S蛋白基因C末端50个氨基酸残基所对应的DNA序列，所述PCR产物DNA的3’ -端添加终止密码，两端添加与DNA克隆载体适配的内切酶位点； 步骤b)将目标克隆载体进行PCR扩增，打开LacZ α基因3’ -末端，去除LacZ α基因的固有终止密码，两端分别用内切酶处理； 步骤c)将步骤a)所得产物连接到步骤b)所得产物的LacZ α基因的下游，构成一环状质粒载体。优选的，上述的零背景DNA克隆载体的构建方法，其中所述目标克隆载体是pUC系列的质粒载体。优选的，上述的零背景DNA克隆载体的构建方法，其中所述目标克隆载体为PUC18 或 pUC19。本专利技术的零背景DNA克隆载体的构建方法，适用于包括克隆载体和表达载体在内的所有类型的载体的制备，其中表达载体包括原核表达载体、真菌表达载体、昆虫表达载体、哺乳类动物表达载体或植物表达载体。本专利技术的突出效果为本专利技术的零背景DNA克隆载体的构建方法提供了一种正性(Positive)筛选重组体的方法，降低DNA克隆时空载体发生率，节省克隆鉴定成本和时间同时，比现有技术中的“零背景载体”具有更少的蓝斑。以下便结合实施例附图，对本专利技术的具体实施方式作进一步的详述，以使本专利技术技术方案更易于理解、掌握。附图说明图1是本专利技术WHV-S蛋白基因与LacZa基因形成融合蛋白的示意 图2是本专利技术实施例WHV-S蛋白基因的序列放在克隆区或其下游，启动子位于上游的示意图。具体实施例方式下面通过具体实施例对本专利技术的方法进行说明，但本专利技术并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。本专利技术提供了一种WHV-S蛋白基因，所述WHV-S蛋白基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1的核苷酸序列，所述WHV-S蛋白基因可以与蓝斑相关蛋白LacZa基因融合表达，如图1所示。本专利技术还提供了所述WHV-S蛋白基因编码的WHV-S蛋白具有序列表中SEQ IDNO:2的氨基酸序列。WHV-S蛋白具有较明显的细胞毒性，属首次披露。本专利技术还提供了所述WHV-S蛋白基因编码全部或部分WHV-S蛋白序列、WHV-S蛋白的同源蛋白序列或者所述WHV-S蛋白序列和WHV-S蛋白的同源蛋白序列的缺失、突变或杂交序列，所述WHV-S蛋白的同源蛋白序列或者所述WHV-S蛋白序列和WHV-S蛋白的同源蛋白序列的缺失、突变或杂交序列具有序列表中SEQ ID NO:SEQ ID NO:6的氨基酸序列，可以在其上游相关启动子的作用下表达WHV-S蛋白(SEQ ID NO: 2)或其同源蛋白(SEQID NO: SEQ ID NO: 6)，使得含有空载体的细胞发生死亡。还包括一具有序列表中SEQ IDNO: 7的核昔酸序列的关键DNA序列，所述关键DNA序列编码的关键融合蛋白具有序列表中SEQ ID NO:8的氨基酸序列。 本专利技术还提供了一种零背景DNA克隆载体，包含或部分包含所述WHV-S蛋白基因DNA分子。本专利技术还提供了一种零背景DNA克隆载体的构建方法，包含如下步骤 1)将野生型或人工合成的WHV-S蛋白基因的DNA序列PCR扩增，扩增的蛋白编码DNA至少包含WHV-S蛋白基因C末端146个氨基酸残基(SEQ ID NO:9)对应的DNA序列(SEQ IDNO: 10)，或者最小为50个氨基酸残基对应的DNA序列，在其PCR产物DNA的3’ -端添加终止密码；两端添加与载体适配的内切酶位点； 2)将目标克隆载体(如pUC18或pUC19)PCR扩增，打开LacZa基因3’-末端，得到在LacZa末端线性化的载体，去除LacZ α基因的固有终止密码，两端分别用合适的内切酶处理； 3)将步骤I)和步骤2)所得产物相互连接，将WHV-S蛋白基因顺向插入LacZα基因的下游； 4)将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，不加IPTG铺板； 5)挑取步骤4)所得大肠杆菌克隆，克隆鉴定后，扩增重组正确质粒DNA； 6)提取质粒DNA，行DNA测序分析，得到的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种WHV?S蛋白基因，其特征在于：所述WHV?S蛋白基因的核苷酸序列为序列表中SEQ?ID?NO:1的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李万波，
申请(专利权)人：盘古基因科技苏州有限公司，姚卓，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。