本发明专利技术揭示了一种亲和兼容性链霉亲和素突变体及其制备方法，所述亲和兼容性链霉亲和素突变体的氨基酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:9所示，其核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:10所示，包含4个氨基酸的突变，分别为Y22N、N23Y、S52G、R53D。本发明专利技术提供了一种亲和兼容性链霉亲和素突变体及其制备方法，降低了对生物素的亲和力，提高了对生物素衍生物（如2-亚氨基生物素）的亲和兼容性，有利于在生物素化蛋白的分离、纯化，其产物可用作亲和色谱填料制备。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程、蛋白质工程和发酵工程领域，涉及一种DNA分子的合成、突变、重组和载体构建技术，尤其涉及。
技术介绍
链霉亲和素(Streptavidin,SA)是由阿维丁链霉菌(Streptomyces avidinii)培养过程中分泌的一种小分子非糖基化蛋白质，全长编码区183个氨基酸(aa)，包含24aa的信号肽(见序列表中SEQ ID No: 1)，成熟分子159aa (见序列表中SEQ ID No: 2)。菌体外的天然活性形式为从13 139aa的成熟肽(见序列表中SEQ ID No: 3)，分子量15kD，其天然形式为同源四聚体，分子量60kD，SA的成熟活性结构为127个氨基酸的多肽，称为SA核心序列，具有抗蛋白酶的特性。1963年，Dr.Stapley首先发现并报道。本世纪以来，SA由于其与生物素(Biotin，又称维生素H、辅酶R)有极高的亲和力和特异性而受到国际生物学和医学界的高度重视。SA对其配体生物素的亲和力(10_16 M/L)比已知的抗原-抗体的亲和力(10_7 10_12 M/L)高4 6个数量级。高亲和力和高特异性并不是SA的唯一特性，SA与Biotin的结合速度极快，即便是在极低浓度和4°C环境下也是如此。另外，由于生物素是小分子，因而蛋白生物素化几乎不影响生物功能。SA-Biotin复合物可以耐受变性剂(如6M盐酸胍)、去垢剂(如SDS)、90°C高温和3 IlpH环境。与其他靶向标签(如Halo-Tag和SNAP-Tag)相比，SA有更多便利，不论是体外或体内，其可借助大肠杆菌的生物素连接酶(E.coli biotin ligase)将其配体标记到目标蛋白。SA的这些特性，引发了科学家对SA和其配体Biotin进行各种生物改造的兴趣。野生型SA (WtSA)分子与Biotin的结合速度(on-rate)虽然很快,但结合力不够稳定持久(high off-rate),这对需要连续长时间观察的动态实验(如细胞生物学领域)与影像研究较为不利。另一方面，WtSA与生物素的异乎寻常的亲和力(10_16mole/L)，又使得分离制备时，需要变性条件下洗脱。尽管WtSA对生物素的亲和力极高，但其对某些极具用途的生物素衍生物，如2-亚氨基生物素，则结合力不够理想(兼容性不理想)，这也提出了对SA进行分子改造的必要。尽管过去20年来，已经报道有200多种突变型SA (mtSA)，但关于SA突变后提高结合稳定性的研究很少。2012年，Mark Howarth, Oxford (GB)公开了稳定性结合SA突变体研究(美国专利申请号:US 2012/0214970 Al)，测试并保护了 3个双位点突变体S52G/R53D, S52G/R53N, S52G/R53S (见序列表中 SEQ ID No: 4，SEQ ID No: 5，SEQ ID No: 6)，指出该类突变体的主体序列必须在第23、27、43、45、49、79、88、90、92、108、110、120、128与野生型SA相同。早在2000 年，R.Charles Cantor (Boston University)对 SA 的亲和兼容性进行了研究，公开了 2个SA的突变体(EP0977770 Al )，它们是N23A、S27E或S27D (见序列表中SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8)， 该突变体对Biotin的亲和力降低了至少10个数量级，提高了对2-亚氨基生物素(2-1minobiotin)和Diaminobiotin的亲和力，可用于分离2-亚氨基生物素化的蛋白。
技术实现思路
鉴于上述现有技术存在的缺陷，本专利技术的目的是提出一种全人工基因合成的密码子优化和突变引入的亲和兼容性链霉亲和素突变体SA128m4及其制备方法，亲和兼容性链霉亲和素突变体SA128m4既有兼容性亲和力，又有低的解离速度(off-rate)。本专利技术的目的将通过以下技术方案得以实现: 一种亲和兼容性链霉亲和素突变体，所述亲和兼容性链霉亲和素突变体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0:9所示，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:10所示。优选的，上述的一种亲和兼容性链霉亲和素突变体，其中:所述亲和兼容性链霉亲和素突变体包含4个氨基酸的突变，分别为Y22N、N23Y、S52G、R53D。一种上述的亲和兼容性链霉亲和素突变体的制备方法，包括以下步骤: O已知的具有127个氨基酸的链霉亲和素成熟氨基酸，其氨基酸序列如序列表中SEQID NO: 3所示，在其N端添加Met氨基酸作为起始密码安置，形成128个氨基酸序列，并在其中引入两个氨基酸的定点突变:S·52G、R53D，以及两个氨基酸的换位突变:Y22N、N23Y，得到的128个氨基酸的突变序列如序列表中SEQ ID N0:9所示； 2)将所述128个氨基酸的突变序列经DNAWorks逆翻译成核苷酸序列，所述核苷酸序列的密码子经DNAWorks优化(E.coli class II)，并且在其5’ -端添加了 NcoI酶切位点，3’_端添加终止密码TAA和XhoI酶切位点，在上下游酶切位点外侧各加4个保护碱基，DNA合成仪合成10条寡核苷酸引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 11 20所示； 3)将所述10条寡核苷酸引物通过PCR合成人工DNA序列，所述人工DNA序列编码128个氨基酸的突变序列，命名为SA128m4，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:21所示，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0:9所示，包含4个氨基酸的突变，分别为Y22N、N23Y、S52G、R53D ； 4)构建原核表达工程载体pET28a-SA128m4； 5)构建原核表达工程菌株BL21(DE3)-pET28a-SA128m4 ； 6)原核表达工程菌株BL21(DE3)-pET28a-SA128m4的扩增、诱导表达； 7)SA128m4的提取与纯化； 8)SA128m4的生物活性测定，所述SA128m4的突变包含Y22N、N23Y、S52G、R53D，由于已知S52G、R53D突变可以使得结合稳定性加强，解离(off-rate)速度变慢，而新的Y22N、N23Y的转位突变则使得SA与Biotin氢键结合的空间位置发生变化，抑制了 SA对Biotin的过高亲和力，提高了对Biotin衍生物(2-1minobiotin, 2-亚氨基生物素)的亲和力。本专利技术的突出效果为:本专利技术提供了，亲和兼容性链霉亲和素突变体SA128m4结合了 SA (S52G，R53D)突变的结合稳定性(low off-rate)和SA (N23A，S27D)的亲和兼容性，降低了对生物素的亲和力，提高了对生物素衍生物(如2-亚氨基生物素)的亲和兼容性，有利于在生物素化蛋白的分离、纯化，其产物可用作亲和色谱填料制备。以下便结合实施例附图，对本专利技术的具体实施方式作进一步的详述，以使本专利技术技术方案更易于理解、掌握。附图说明图1是重组表达载体pET28a_SA128m4的物理结构图。具体实施例方式下面通过具体实施例对本专利技术的方法进行说明，但本专利技术并不局限于此。下述实施例中所述实验方法本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种亲和兼容性链霉亲和素突变体，其特征在于：所述亲和兼容性链霉亲和素突变体的氨基酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:9所示，其核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:10所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李万波，黄勇，陕婧婧，管春爱，贾翔，
申请(专利权)人：盘古基因科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：
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