标签GST的一种不可逆亲和标记试剂及应用制造技术

标签谷胱甘肽‑S‑转硫酶sjGST的一种不可逆亲和标记试剂，包括N‑(对甲氧基苯氧乙基)‑(N‑对位取代酰胺基苯甲酰基)甘氨酸类单价标记试剂，及其与二烷基三胺衍生所得双酰胺类二价标记试剂；所述不可逆标记试剂含四类功能基，即对甲氧基苯氧乙基类疏水定位基引导标记试剂进入GST活性中心疏水位点、α‑卤代酰基为代表的修饰功能基与GST活性中心附近巯基/氨基反应、N‑双取代氨基酸类偶联功能基与微纳米材料成酰胺偶联、对氨基苯甲酸或谷氨酸或二者酰化产物为连接骨架提供修饰功能基所需柔性臂；此类亲和标记试剂经偶联功能基的羧基/氨基与微纳米材料氨基/羧基成酰胺偶联后，用于亲和标记sjGST实现融合表达蛋白的活性位点外共价连接，制备蛋白功能化新型微纳米材料。

【技术实现步骤摘要】
标签GST的一种不可逆亲和标记试剂及应用
本专利技术属于蛋白质生物
，涉及针对融合表达标签谷胱甘肽-S-转硫酶(siGST)活性位点的不可逆亲和标记试剂，及将此亲和标记试剂偶联到微纳米材料表面后对GST融合蛋白实现位点选择性固定化的应用。此GST亲和标记试剂的设计，是针对GST活性中心的H位点设计大体积疏水配基并在合适位置添加高反应活性的基团，使其与GST活性位点结合后与活性位点附近特定官能团形成共价键，实现不可逆亲和标记；将此亲和标记试剂偶联到微纳米材料表面且保留其亲和标记活性则能实现GST融合表达蛋白活性位点之外的位点选择性固定化，制备蛋白功能化的微纳米材料。
技术介绍
蛋白功能化材料包括固定化蛋白的微整列芯片、微纳米材料等，在蛋白质生物
有广泛的应用，如生物分子高通量筛选、蛋白pull-down、微流体催化等[NatChem.2016，8：103-113]。相对于DNA固定化，蛋白固定化面临的技术挑战主要在于如何控制其连接反应的位点选择性和蛋白取向一致性从而尽可能保留被固定蛋白的活性。显然，必须蛋白位点选择性固定化，而且为了形成稳定的加合物，位点选择性共价固定化的思路更有吸引力。微纳米材料是指直径在1nm～100μm的微球(微囊)和厚度在1nm～100μm的薄膜，包括但不限于微纳米磁珠和蛋白共价加合物/蛋白聚合物颗粒。现有在微纳米材料表面的蛋白位点选择性固定化策略包括：1)基于标签的固定化如GST标签、HaloTag标签、His标签等与亲和标记试剂反应[BioconjugChem.2014，25(10)：1902-1909]；2)靶酶工程化氨基酸经酶催化或高选择性化学反应共价链接，如点击化学反应；3)基于生物素链亲和素高亲和力结合等非共价固定化[NatCommun.2016，7：13128；Molecules.2016，21(10)：1370；ChemRev.2015，115(5)：2174-2195；PharmRes.2011，28(7)：1480-1499；Biomacromolecules.2007，8(6)：1775-1789]。不同应用常需不同固定化方法。基于磁珠固定化靶蛋白，“联用磁分离与色谱分析测定混合物中配体亲和力的方法”[中国专利技术专利ZL200810237298.2]，有望用于液相组合合成混合物库和天然药物提取物中发现高亲和力配体为先导配体，但需特殊的蛋白质固定化策略。GST融合表达标签(sjGST)适于亲和纯化靶蛋白并具有一定的增溶能力，被广泛应用于真核靶蛋白在原核系统大量低成本可溶表达及纯化。基于sjGST的自催化或化学固定化策略均有报道[BioconjugChem.2014，25(11)：1911-1915；BioconjugChem.2014，25(10)：1902-1909；BioconjugChem.2013，24(4)：571-577；BioconjugChem.2013，24(8)：1295-1301；JOrgChem.2013，78(19)：9647-9658；JAmChemSoc.2004，126(38)：12047；JAmChemSoc.2003，125(26)：7810-7811；BioconjugChem.2005，16(4)：1009-1018]。但值得注意的是，GST是二聚体，有两个大体积的疏水结合位点，对配体选择性低；目前所见基于sjGST的固定化方法中，并未实现完全封闭其疏水结合位点，所得功能材料将面临疏水小分子的非特异性结合，不适用于筛选小分子配体库。本专利技术设计sjGST不可逆亲和标记试剂并尽可能封闭二聚体中双活性中心的疏水位点，使基于sjGST的磁珠固定化靶蛋白也适用于小分子配体库筛。
技术实现思路
本专利技术设计标签GST的疏水大体积亲和标记试剂，偶联到微纳米材料表面后用于亲和标记固定化GST融合蛋白，同时采用特殊策略封闭其二聚体中两个活性中心的疏水位点以避免功能化材料对疏水小分子的结合。本
技术实现思路
如下：1.N-(对甲氧基苯氧乙基)-(N-对位取代酰胺基苯甲酰基)甘氨酸类标签GST的单价不可逆亲和标记试剂，其与标记活性对应的显著结构特点是包括至少四种功能基，其对应作用在于：(1)引导亲和标记试剂进入活性位点疏水腔的对甲氧基苯氧乙基，也称为疏水定位基；(2)与活性中心附近巯基、胺基发生亲核取代反应的修饰基团，包括但不限于1-卤代乙酰基、丙烯酰基、N-烷基马来酰亚胺基、乙烯磺酰基；(3)将亲和标记试剂偶联到微纳米材料表面的偶联功能基，包括但不限于甘氨酸、β-氨基丙酸，γ-氨基丁酸、δ-氨基戊酸，以其羧基与材料表面氨基偶联；(4)疏水定位、修饰功能基及偶联功能基之间的连接骨架功能基，包括但不限于对氨基苯甲酰基、6-氨基己酰基、γ-谷氨酰基、及对氨基苯甲酰基的氨基与所述氨基酸形成的酰胺衍生物，以其氨基与修饰基团相连而酰基与偶联基团的氨基相连；2.据权利要求1所述(N-对甲氧基苯氧乙基)-(N-对位取代酰胺基苯甲酰基)甘氨酸类标签GST单价不可逆亲和标记试剂，其应用特征在于经微纳米材料表面氨基与单价标记试剂偶联功能基中羧基成酰胺键偶联后用于亲和标记固定化GST融合蛋白，使亲和标记试剂疏水定位基进入GST活性位点疏水腔，借助连接基团的柔韧性，使修饰基团能对活性中心附近巯基或氨基能实现共价修饰，从而实现对GST不可逆亲和标记；3.据权利要求1所述(N-对甲氧基苯氧乙基)-(N-对位取代酰胺基苯甲酰基)甘氨酸类标签GST的单价不可逆亲和标记试剂，其特征在于：所述单价不可逆亲和标记试剂，通过偶联功能基中羧基与二乙基三胺或二丙基三胺的末端伯氨基缩水成双酰胺，转变成能同时结合到GST两个活性中心的二价不可逆亲和标记试剂，以其亚氨基为偶联基团或该亚胺基与丁二酸酐或戊二酸酐反应所得羧基为偶联基团对应与材料表面羧基或氨基偶联；4.据权利要求1所述(N-对甲氧基苯氧乙基)-(N-对位取代酰胺基苯甲酰基)甘氨酸类标签GST的单价不可逆亲和标记试剂，及其衍生的二价不可逆亲和标记试剂，与微纳米材料偶联过程有如下特征：非蛋白类微纳米材料与相对于表面可反应基团过量的标记试剂在包括但不限于N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙腈中经脱水缩合成酰胺偶联得亲和标记试剂偶联微纳米材料；对蛋白类微纳米材料，先将亲和标记试剂在所述溶剂中用水溶性活化剂包括但不限于1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺加N-羟基琥珀酰亚胺活化，再加蛋白微纳米材料偶联；5.据权利要求1所述(N-对甲氧基苯氧乙基)-(N-对位取代酰胺基苯甲酰基)甘氨酸类标签GST的单价不可逆亲和标记试剂，及其衍生的二价不可逆亲和标记试剂，与微纳米材料偶联后，对GST或其融合蛋白的固定化及封闭过程有如下特征：在缓冲液中加入相对于亲和标记试剂偶联微纳米材料表面反应官能团过量的GST或其融合蛋白进行不可逆亲和标记；再用过量单价标记试剂封闭固定化GST中的未修饰活性中心；最后用过量半胱氨酸、谷胱甘肽、巯基乙醇、巯基乙酸、巯基乙磺酸之一或其混合物，将偶联在微纳米材料表面的剩余亲和标记试剂转变成亲水基团；以避免功能化材料对疏水小分子的结合。附图说明附图1标记试剂合成路线附图2标记试剂(Br-I)和(Br-II)对sjGST的半本文档来自技高网...

【技术保护点】
N‑(对甲氧基苯氧乙基)‑(N‑对位取代酰胺基苯甲酰基)甘氨酸类标签GST的单价不可逆亲和标记试剂，其与标记活性对应的显著结构特点是包括至少四种功能基，其对应作用在于：

【技术特征摘要】
1.N-(对甲氧基苯氧乙基)-(N-对位取代酰胺基苯甲酰基)甘氨酸类标签GST的单价不可逆亲和标记试剂，其与标记活性对应的显著结构特点是包括至少四种功能基，其对应作用在于：(1)引导亲和标记试剂进入活性位点疏水腔的对甲氧基苯氧乙基，也称为疏水定位基；(2)与活性中心附近巯基、胺基发生亲核取代反应的修饰基团，包括但不限于1-卤代乙酰基、丙烯酰基、N-烷基马来酰亚胺基、乙烯磺酰基；(3)将亲和标记试剂偶联到微纳米材料表面的偶联功能基，包括但不限于甘氨酸、β-氨基丙酸，γ-氨基丁酸、6-氨基戊酸，以其羧基与材料表面氨基偶联；(4)疏水定位、修饰功能基及偶联功能基之间的连接骨架功能基，包括但不限于对氨基苯甲酰基、6-氨基己酰基、γ-谷氨酰基、及对氨基苯甲酰基的氨基与所述氨基酸形成的酰胺衍生物，以其氨基与修饰基团相连而酰基与偶联基团的氨基相连。2.据权利要求1所述(N-对甲氧基苯氧乙基)-(N-对位取代酰胺基苯甲酰基)甘氨酸类标签GST单价不可逆亲和标记试剂，其应用特征在于经微纳米材料表面氨基与单价标记试剂偶联功能基中羧基成酰胺键偶联后用于亲和标记固定化GST融合蛋白，使亲和标记试剂疏水定位基进入GST活性位点疏水腔，借助连接基团的柔韧性，使修饰基团能对活性中心附近巯基或氨基能实现共价修饰，从而实现对GST不可逆亲和标记。3.据权利要求1所述(N-对甲氧基苯氧乙基)-(N-对位取代酰胺基苯甲酰基)甘氨酸类标签GST的单价不可逆亲和标记试剂，其特征在于：所述单价不可逆亲和标记试剂，通...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨晓兰，夏超，廖飞，胡小蕾，张祥，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50