梅毒螺旋体总抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒及其制备方法，涉及梅毒抗体的检测。试剂盒设有浓缩洗涤液瓶、阴阳性对照品瓶、生物素标记重组抗原瓶、辣根过氧化物酶标记亲和素瓶、TMB显色液A瓶、显色液B瓶、反应终止液瓶、包被有重组抗原微孔板。以梅毒螺旋体有传染性标准株Nichol株和梅毒螺旋体无传染性的标准株Reiter株，采用蛋白组学方法，通过双向电泳分离梅毒螺旋体蛋白质组，再用不同病人或感染动物的血清鉴定出具有强免疫原性的蛋白质，寻找抗原标志物。用于梅毒确认试验，提高实验诊断灵敏度和特异性，缩短窗口期。可灵敏检测出梅毒螺旋体抗体，可对其进行定量鉴定，价格便宜，操作简单，结果准确，环保无污染。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】，涉及梅毒抗体的检测。试剂盒设有浓缩洗涤液瓶、阴阳性对照品瓶、生物素标记重组抗原瓶、辣根过氧化物酶标记亲和素瓶、TMB显色液A瓶、显色液B瓶、反应终止液瓶、包被有重组抗原微孔板。以梅毒螺旋体有传染性标准株Nichol株和梅毒螺旋体无传染性的标准株Reiter株，采用蛋白组学方法，通过双向电泳分离梅毒螺旋体蛋白质组，再用不同病人或感染动物的血清鉴定出具有强免疫原性的蛋白质，寻找抗原标志物。用于梅毒确认试验，提高实验诊断灵敏度和特异性，缩短窗口期。可灵敏检测出梅毒螺旋体抗体，可对其进行定量鉴定，价格便宜，操作简单，结果准确，环保无污染。【专利说明】梅毒螺旋体总抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒及其 制备方法
本专利技术涉及梅毒抗体的检测，尤其是涉及梅毒螺旋体总抗体生物素亲和素酶联免 疫检测试剂盒及其制备方法。
技术介绍
梅毒是梅毒螺旋体引起的性传播性疾病，近年来在国内的发病率居高不下，梅毒 的防控已成为我国公共卫生服务的主要任务之一。 梅毒的实验室诊断方法主要有如下几种（林丽蓉，杨波，潘锡涛，等.潜 在的血源传播患者梅毒血清学检测方法的选择.中华医院感染学杂志.2010,20(10): 1491-1494)： (1)病原学检测：梅毒螺旋体感染早期，当梅毒抗体还未产生或含量较低时，暗视 野显微镜查找螺旋体成为最早的实验室诊断方法，但易受取材技术、取材部位、样本中梅毒 螺旋体含量、局部用药及送检时间等诸多因素影响，灵敏度较低。 (2)抗体检测试验：梅毒螺旋体不能进行体外培养，诊断主要依赖于实验室检查， 现有的血清学检测灵敏度、特异性不高，任何一种检测方法均存在缺陷，临床漏诊和误诊率 较闻。 用于梅毒血清学检验的抗原主要以重组抗原TPN15、TPN17、TPN37、 TPN44. 5、TPN47 为主（Lin，L.R.，Z.G.Fu，et al. "Development of a colloidal gold-immunochromatography assay to detect immunoglobulin G antibodies to Treponema pallidum with TPN17and TPN47. "Diagnostic microbiology and infectious disease. 2010. 68 (3) : 193-200.)，这些抗原大多来源于梅毒螺旋体外膜，但不能区分是否 为致病性螺旋体所致。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供梅毒螺旋体总抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒及 其制备方法。 所述梅毒螺旋体总抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒，设有： 外包装盒、浓缩洗涤液瓶、阴性对照品瓶、阳性对照品瓶、生物素标记重组抗原瓶、 辣根过氧化物酶标记亲和素瓶、TMB显色液A瓶、显色液B瓶、反应终止液瓶、包被有重组抗 原微孔板； 浓缩洗涤液瓶、阴性对照品瓶、阳性对照品瓶、生物素标记重组抗原瓶、辣根过氧 化物酶标记亲和素瓶、TMB显色液A瓶、显色液B瓶、反应终止液瓶和包被有重组抗原微孔 板装在外包装盒内； 浓缩洗涤液瓶内装有浓缩洗涤液，阴性对照品瓶内装有阴性对照品，阳性对照品 瓶内装有阳性对照品，生物素标记重组抗原瓶内装有生物素标记重组抗原，辣根过氧化物 酶标记亲和素瓶内装有辣根过氧化物酶标记亲和素，TMB显色液A瓶内装有TMB显色液A， 显色液B瓶内装有显色液B，反应终止液瓶内装有反应终止液； 所述TMB显色液A为3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺 (3, 3,，5, 5, -Tetramethylbenzidine，TMB)显色液； 所述显色液B为3%的过氧化氢溶液。 所述浓缩洗涤液可采用溶有Tween-20的磷酸盐缓冲液，其中Tween-20的终浓度 为0. 05%，使用时用蒸馏水进行20倍稀释。 所述阴性对照品为梅毒螺旋体总抗体阴性对照品，由非梅毒感染的健康人群血 清配制而成，使用本试剂盒进行检测其0D450nm吸光值小于0. 1 ;所述0D450nm为主波长， 450nm是测定的样本显色吸光值。 所述阳性对照品为梅毒螺旋体总抗体阳性对照品，由梅毒患者的阳性血清配制而 成，用本试剂盒进行检测其〇D450nm吸光值大于0. 5 ;所述0D450nm为主波长，450nm是测定 的样本显色吸光值。 所述TMB显色液A为3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺 (3, 3'，5, 5' -Tetramethylbenzidine，TMB)显色液，商品名叫TMB显色液A，市售品可购自厦 门波生生物科技有限公司。 所述显色液B为3%的过氧化氢溶液，商品名叫显色液B，市售品可购自厦门波生 生物科技有限公司。 所述反应终止液可采用摩尔浓度2mmol/L的硫酸。 所述瓶可采用聚乙烯瓶。 所述梅毒螺旋体总抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒的制备方法，包括以下 步骤： 1)提取梅毒螺旋体Nichol株和Reiter株外膜蛋白进行双向电泳后，转移至硝 酸纤维素膜上，用梅毒血清进行免疫印迹实验，获得特征性的免疫印迹斑点，取对应的蛋白 点进行质谱分析，分别找出Nichol株和Reiter株具有较高免疫原性的外膜蛋白，并找出 Nichol株特有而Reiter株缺少的高免疫原性的外膜蛋白；在梅毒螺旋体的全基因组序列 中找出对应基因，设计引物并构建相应的表达载体，根据不同诱导条件对重组目标蛋白在 大肠杆菌中表达量的影响，获得最佳诱导条件，大量扩增目标蛋白，收集过表达的目标蛋白 进行纯化；将候选抗原通过免疫大鼠获得其相应多克隆抗体，采用酶联免疫方法测定抗体 滴度，并使用免疫印迹方法验证这些重组抗原的免疫原性；采用基因克隆技术，PCR扩增编 码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得到梅毒螺旋体重组抗原； 2)将步骤1)得到的梅毒螺旋体重组抗原与活化的生物素混合进行标记，透析去 除未结合的生物素，得到生物素标记重组抗原； 3)将步骤1)得到的梅毒螺旋体重组抗原用包被缓冲液稀释至20 μ g/mL，以每孔 0. lmL加入微孔板中，4?包被24h ;取出抗原板，风干；用0. 01mmol/L pH7. 4磷酸盐缓冲液 配制的1. 0%脱脂奶粉，每孔0. 2mL，4°C封闭24h，取出用磷酸盐缓冲液洗涤5次，室温风干、 消毒、密封，得包被有重组抗原微孔板； 4)采用过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶标记，得辣根过氧化物酶标记亲和素； 5)TMB显色液A采用市售品，可购自厦门波生生物科技有限公司； 6)显色液B采用市售品，可购自厦门波生生物科技有限公司； 7)配制溶有Tween-20的磷酸盐缓冲液，其中Tween-20的终浓度为0· 05%，得浓 缩洗涤液，使用时可用蒸馏水进行20倍稀释； 8)配制摩尔浓度为2mmol/L的硫酸作为反应终止液； 9)由非梅毒感染的健康人群血清配制梅毒螺旋体总抗体阴性对照品，使用本试剂 盒进行检测其〇D450nm吸光值小于0· 1 ;所述0D450nm为主波长，450nm是测定的样本显色 吸光值； 10)本文档来自技高网...
【技术保护点】
梅毒螺旋体总抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒，其特征在于设有外包装盒、浓缩洗涤液瓶、阴性对照品瓶、阳性对照品瓶、生物素标记重组抗原瓶、辣根过氧化物酶标记亲和素瓶、TMB显色液A瓶、显色液B瓶、反应终止液瓶、包被有重组抗原微孔板；浓缩洗涤液瓶、阴性对照品瓶、阳性对照品瓶、生物素标记重组抗原瓶、辣根过氧化物酶标记亲和素瓶、TMB显色液A瓶、显色液B瓶、反应终止液瓶和包被有重组抗原微孔板装在外包装盒内；浓缩洗涤液瓶内装有浓缩洗涤液，阴性对照品瓶内装有阴性对照品，阳性对照品瓶内装有阳性对照品，生物素标记重组抗原瓶内装有生物素标记重组抗原，辣根过氧化物酶标记亲和素瓶内装有辣根过氧化物酶标记亲和素，TMB显色液A瓶内装有TMB显色液A，显色液B瓶内装有显色液B，反应终止液瓶内装有反应终止液；所述TMB显色液A为3,3',5,5'‑四甲基联苯胺显色液；所述显色液B为3％的过氧化氢溶液。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：林丽蓉，童曼莉，刘莉莉，张惠林，杨天赐，张长弓，
申请(专利权)人：厦门大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：福建;35
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