一种针对玉米细菌性萎蔫病菌的生物素－亲和素酶联免疫检测方法，包括以下步骤：制备上述的多克隆抗体、纯化并进行生物素标记；样品中细菌的提取，将样品提取液包被在微孔板上；之后相继加入生物素标记抗体、碱性磷酸酶标链霉亲和素复合物及ＰＮＰ底物，显色后用酶标仪读取波长在４０５ｎｍ下的吸光度值；本发明专利技术提供的玉米细菌性萎蔫病菌生物素－亲和素酶联免疫检测方法，特异性强，灵敏度高，检测灵敏度达到１×１０↑［６］ｃｆｕ／ｍＬ，操作简便快速，结果准确高效。
【技术实现步骤摘要】
木专利技术涉及一种酶联免疫检测方法，特别是涉及一种及检测试剂盒。
技术介绍
玉米(内州)萎蔫病又称玉米细菌性萎蔫病(Goss' s bacterial wilt and blight of maize,67sw'& "er啦'c力i^3/7e/7sis subsp. /;eZv^s^e/757'50，是一禾中可以造成严重玉米损失的植物病害。1969年，该病首次在美国内不拉斯加州道森县发生，之后陆续蔓延到克罗拉罗州、伊利诺斯州、爱荷华州、肯萨斯州、密歇根州、明尼苏达州，内布拉斯加州、南达科他州和威斯康星州，至2000年己经扩散至加拿大的安大略湖区。萎蔫病的危害性和分布区域的扩张蔓延引起人们的高度重视，欧盟、加拿大等国都己经建立了该病的风险评估体系。我国于2007年5月将该病菌列入最新修订的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。玉米细菌性萎蔫病有两种主要表现形式， 一为叶片萎蔫，二为系统枯萎。该病在叶片上最初为不连续的水渍状斑点，初为暗绿色至黑色，后变褐色，与叶脉平行，表面常有细菌溢脓。系统侵染时，维管束变色，根和近地面的茎秆干腐或水渍状褐腐。玉米幼苗和成株均可发病。细菌通过伤口侵染，也可直接通过叶片侵染或者细嫩植株的根和茎杆系统侵染引起发病。苗期侵染引起萎蔫、死亡，后期侵染造成植株矮化，叶片上出现灰白色或黄绿色条纹，条纹边缘波浪形或不规则形，有吋有黑色斑点，最后干枯。酶联免疫吸附方法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)是实施生物检测(涉及包括人类病原菌，动植物病原菌，生物毒素，农兽药残留，蛋白质，DNA等多种/类生物体和化合物)的最为行之有效和重要的手段之一。鉴于生物素-亲和素反应体系的高亲和力和高特异性，近些年在ELISA检测中得到广泛重视。目前，国内外尚未见玉米细菌性萎蔫病菌ELISA检测研究的报道，建立灵敏、稳定的玉米细菌性萎蔫病菌生物素-亲和素ELISA检测方法(biotin-avidinELISA)是玉米检疫的迫切要求。
技术实现思路
本专利技术的目的是建立一种满足特异性和高灵敏的多克隆抗体的，并研制出试剂盒，为玉米细菌性萎蔫病菌检测提供一种高效、简便的技术手段。4一种抗玉米细菌性萎蔫病菌多克隆抗体，所述多克隆抗体的效价在IO"以上；所述多克隆抗体采用间接ELISA法测定其特异性，其与2株玉米细菌性萎蔫病菌(ATCC 27822， ATCC33114)表现强烈反应，而与相关的其他11个病原细菌种或亚种无交叉反应，供试细菌菌体浓度为lx108—9 cfu/mL。本专利技术的抗玉米细菌性萎蔫病菌多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤(1) 制备免疫原供试的玉米细菌性萎蔫病菌接种于液态NBY培养基上，28 'C下恒温振荡培养，在细菌生长对数期收集菌体；12000 g离心10分钟，倒去上清液，菌体用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)复溶，反复离心清洗三次后再加入无菌PBS复悬，比浊法计数并定溶菌体浓度到lxlOs lxl09cfu/raL，制得细菌菌体悬液；(2) 动物免疫取上述菌悬液按常规免疫方法对供试家兔进行免疫操作后，采集血清，并分装后于-2(TC下保存；(3) 纯化抗体从上述血清中筛选出效价表现最高的抗血清(效价在10—4以上)进行纯化，抗体浓度定溶为l.O mg/mL,即得抗玉米细菌萎蔫病菌多克隆抗体。本专利技术的抗玉米细菌性萎蔫病菌多克隆抗体的制备方法，所述步骤(3)中抗血清的纯化方法为硫酸铵沉淀法和Protein A柱亲和层析法。--种，包括以下步骤将上述的多克隆抗体进行生物素标记，制备样品提取液或菌悬液，然后在微孔板上包被样品提取液或菌悬液，之后相继加入生物素标记抗体、碱性磷酸酶标链霉亲和素和PNP底物，显色后用酶标仪读取波长在405 nm下的吸光度值。其中所述检测方法以健康玉米粉悬浮液作为阴性对照，玉米细菌性萎蔫病菌悬液作为阳性对照进行ELISA检测。样本吸光度值与其所含玉米细菌性萎蔫病菌含量成正相关，采用P/N》2. 0作为阳性结果的判定标准。其检测灵敏度达到lx106 cfu/mL。本专利技术的，其中所述抗体进行生物素标记的方法为取1.0mg/mL的lmL抗体(IgG)用CBS缓冲液4°C下透析过夜，期间换3次缓冲液，加入100 ul标记试剂在室温下反应30 min，然后加入100 ul 1M Tris/HCl终止反应，用0. 85% NaCl缓冲液4"C下透析过夜，期间换3次缓冲液，得到生物素标记的抗体；其中所用的标记试剂为1 mg生物素与1 mL二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO)充分溶解得到的。其中所述样品提取液的制备方法为取30g玉米籽粒样品用无菌水冲洗3次，在300ml碳酸缓冲液中浸泡过夜，然后将种子研磨破碎，获得浓度为C. 1 g/mL的玉米组织悬浮液；所述菌悬液的制备方法为将玉米细菌性萎蔫病菌和培养基的冻干粉用无菌水制备成 lX10gCfU/mL的菌悬液，将等体积的此菌悬液与上述玉米组织悬浮液混合，形成5Xl()8cfu/mL 样品液，再通过倍比稀释分别配成lx108， 5X107， 107， 5X106， l(f， 5X10S， 105cfu/mLW菌悬液。一种根据所述的检测方法组建的玉米细菌性萎蔫病菌生物素-亲和素酶联免疫检测试剂 盒，可供200孔检测用，使其包含下述组分A、 检测抗体用生物素标记的上述的玉米细菌性萎蔫病菌多克隆抗体；容量0. 125mL 使用浓度0. 1 mg/mL 稀释倍数1:200抗体液含量0.5 ug/mL 防腐剂0.05% NaN3贮藏4 。C下6个月B、 酶标链霉亲和素复合物；容量0.05 raL(含0.05°/。 NaN3) 稀释倍数1:500 贮藏4 。C下6个月C、 IO倍PBST浓缩液1:10稀释后，用于稀释检测抗体、酶标链霉亲和素和洗涤酶标板； 规格60 mL/瓶 贮藏室温D、 IO倍碳酸缓冲液(CBS) : 1:10稀释后，用于样品提取和配制封闭液； 规格60 mL/瓶 贮藏室温E、 封闭液用1倍CBS配制的0.5 % (w/v) BSA或2% (w/v)脱脂奶粉；F、 底物对硝基苯磷酸盐(PNPP)片剂5 mg/片；G、 5倍底物缓冲液1: 5稀释后，用于配制显色液，pH9.8;组分0.5 mol/L二乙醇胺缓冲液规格10 mL/瓶 贮藏室温H、 显色液用底物缓冲液配制的PNPP溶液，lmg/mL，现配现用；I、 终止液2M NaOH溶液；规格50 mL/瓶 贮藏室温J、阳性对照玉米细菌性萎蔫病菌和培养基的冻干粉； K、阴性对照健康玉米籽粒粉。本专利技术提供的及其检测试剂盒，其 中多克隆抗体的制备是用病原细菌注射免疫大白兔并经筛选获得，抗体效价在10—4(1: 10000) 以上；抗体与玉米细菌性萎蔫病菌有特异性反应，而与供试的其他病原细菌种/亚种无交叉反 应；抗体纯化后进行生物素标记，建立了生物素-亲和素间接ELISA (BA-ELISA)，检测灵敏 度达到lxl(fcfu/mL。现在通常的碱性磷酸酶标抗体式间接ELISA采用多克隆抗体直接作为检 测抗体或者用经碱性磷酸酶标记的多克隆抗体作为检测抗体，再加入通用的碱磷酶标羊抗兔6IgG和/或PNP底物显色，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗玉米细菌性萎蔫病菌多克隆抗体，其特征在于：所述多克隆抗体效价在１×１０↑［－４］以上；所述多克隆抗体的特异性，其与２株玉米细菌性萎蔫病菌（ＡＴＣＣ ２７８２２，ＡＴＣＣ ３３１１４）表现强烈反应，而与相关的其他１１个病原细菌种或亚种无交叉反应。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：田世民，邹明强，王岭，哈斯，马吉湘，陈艳，齐小花，金涌，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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