【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子医学，具体是涉及梅毒螺旋体tp47 mrna逆转录一步法实时荧光pcr检测试剂盒及其制备。
技术介绍
1、梅毒(syphilis)是一种由梅毒螺旋体(treponema pallidum，tp)引起的性传播疾病，其病原体是梅毒螺旋体，属螺旋体科。梅毒螺旋体主要通过性接触、输血、创口或者胎盘等途径传播。梅毒螺旋体从感染区附近的淋巴结进入血液播散全身，使机体几乎所有的组织及器官受累，临床表现为全身性的，可分为不同临床阶段，包括一期、二期、三期和潜伏期。显性梅毒的发生率逐年下降，隐性梅毒大幅上升，占比高达80％以上(岳晓丽,龚向东,李婧,等.2014—2019年中国梅毒流行趋势与特征分析[j].中华皮肤科杂志,2021,54(8):668-72.10.35541/cjd.20210098.)。
2、隐性梅毒患者无自觉症状，处于临床静止期(也称之为潜伏梅毒)，但仍具有传染性，可传染给胎儿或他人，是重要的传染源。一旦机体抵抗力下降，隐性梅毒将重新发作，进展为显性梅毒。研究表明约20％隐性梅毒可进展为神经梅毒(lin li rong,zhu xiaozhen,liu dan,et al.are nontreponemal tests suitable for monitoring syphilistreatment efficacy？evidence from rabbit infection models[j].clinicalmicrobiology and infection,2020,26(2):240
3、已有的文献和国内外指南曾认为，梅毒螺旋体非特异性抗体检测可用于评估梅毒疾病活动度或传染性，即随访滴度降低4倍以上或血清转阴表明治疗有效或治愈(satyaputra f.,hendry s.,braddick m.,et al.the laboratory diagnosis ofsyphilis[j].journal of clinical microbiology,2021,59(10):e0010021.10.1128/jcm.00100-21)，但其敏感性和特异性受到感染的分期和免疫抑制的严重程度的影响(kojima n.,siebert j.c.,maecker h.,et al.cytokine expression in treponemapallidum infection[j].j transl med,2019,17:9.10.1186/s12967-019-1947-7)。此外，最近的动物试验研究显示，宿主梅毒螺旋体非特异性抗体的滴度变化与抗生素治疗无关，其滴度降低4倍以上或血清转阴均可能是一种自然过程。如何评价梅毒的活动性和传染性，如何判断是否治愈，仍然是当前梅毒防控的难点，需要找到存在活的梅毒螺旋体的直接证据。
4、梅毒螺旋体dna的载量可以反映梅毒螺旋体的存在以及数量，但不能区分活的或死的梅毒螺旋体。病原体mrna很容易降解，半衰期短，其存在表明存在活的病原体，提示具有传染性或尚未治愈。虽然有研究在梅毒患者的精液标本中检出梅毒螺旋体rna(godornes,charmie,ciccarese,et al.treponema pallidum subsp.pallidum dnaandrnain semen of a syphilis patient without genital or anal lesions[j])，但目前被广泛研究并快速发展的pcr体系通常以梅毒螺旋体dna片段为靶标，尚未有成熟的pcr体系被建立并用于评估检测梅毒感染者体内的梅毒螺旋体基因组dna转录产生的mrna。
5、梅毒螺旋体基因tp47(47kda脂蛋白)为特异性47-kda脂蛋白基因，是梅毒螺旋体最常见的表达基因，具有高度的特异性，该47-kda蛋白为青霉素结合蛋白，与青霉素类的治疗密切相关(smajs d.,mckevitt m.,howell j.k.,et al.transcriptome of treponemapallidum:gene expression profile during experimental rabbit infection[j].journal of bacteriology,2005,187(5):1866-74.10.1128/jb.187.5.1866-1874.2005.)。tp47基因检测在梅毒早期快速诊断、疗效判断、疗程选择、神经梅毒确诊、胎传梅毒诊断，以及献血员、孕产妇、婚前体检、手术患者和输血前筛查等领域发挥重大作用，有着目前常用的血清学检测不可比拟的优势，将逐渐替代这些方法或作为这些方法的验证试验，具有广阔的应用前景和重要的社会经济价值。
技术实现思路
1、本专利技术的第一目的在于提供一种梅毒螺旋体tp47 mrna逆转录一步法实时荧光pcr检测试剂。
2、本专利技术的第二目的在于提供所述梅毒螺旋体tp47 mrna逆转录一步法实时荧光pcr检测试剂的制备方法。
3、本专利技术的第三目的在于提供一种梅毒螺旋体tp47 mrna逆转录一步法实时荧光pcr检测方法。
4、本专利技术所述梅毒螺旋体tp47 mrna检测试剂，包括pcr反应液、酶反应液、标准品、阴性对照品和阳性对照品；
5、其中pcr反应液的成份含有dntp/dutp mix、mg2+、4对引物探针混合物和ddh2o；
6、其中酶反应液的成份含有hiscript ii reverse transcriptase、rnaseinhibitor、heat-labile udg和takara taqhs dna polymerase；
7、标准品含梅毒螺旋体tp47基因和人类rnasep基因的目标片段的装甲rna溶液，包括1.0×102copies/ml、1.0×103copies/ml、1.0×104copies/ml、1.0×105copies/ml、1.0×106copies/ml和1.0×107copies/ml共6个浓度；但不限于此6个浓度标准品。
8、阴性对照品为不含梅毒螺旋体tp47基因，只含人类rnasep基因的目标片段的装甲rna溶液；
9、阳性对照品为含有梅毒螺旋体tp47基因的目标片本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种梅毒螺旋体tp47 mRNA逆转录一步法实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒中含有tp47基因的正向引物tp47-F、反向引物tp47-R和荧光探针tp47-P，以及RNaseP基因的正向引物RNaseP-F、反向引物RNaseP-R和荧光探针RNaseP-P；所述引物和探针的序列如下：
2.如权利要求1所述一种梅毒螺旋体tp47 mRNA逆转录一步法实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒中还含有：PCR反应液、酶反应液、标准品和对照品；
3.如权利要求2所述一种梅毒螺旋体tp47 mRNA逆转录一步法实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于所述引物探针混合物中，引物的浓度为0.2μmol/L，荧光探针的浓度为0.2μmol/L。
4.如权利要求2所述一种梅毒螺旋体tp47 mRNA逆转录一步法实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于所述标准品包括1.0×102copies/mL、1.0×103copies/mL、1.0×104copies/mL、1.0×105copies/mL、1.0×106copies/mL和1.
5.如权利要求2所述一种梅毒螺旋体tp47 mRNA逆转录一步法实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于所述阴性对照品为不含梅毒螺旋体tp47基因，只含人类RNaseP基因的目标片段的装甲RNA溶液；阳性对照品为含有梅毒螺旋体tp47基因的目标片段的装甲RNA溶液。
6.一种梅毒螺旋体tp47mRNA逆转录一步法实时荧光PCR检测方法，其特征在于采用如权利要求1所述梅毒螺旋体tp47 mRNA逆转录一步法实时荧光PCR检测试剂盒评估各类待检测标本的梅毒螺旋体mRNA含量，所述检测方法的具体步骤为：
7.如权利要求6所述一种梅毒螺旋体tp47mRNA逆转录一步法实时荧光PCR检测方法，其特征在于在步骤1)中，所述待检测标本为临床标本包括人体的组织、血液、生殖道分泌物、脑脊液等临床标本，或环境标本。
...【技术特征摘要】
1.一种梅毒螺旋体tp47 mrna逆转录一步法实时荧光pcr检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒中含有tp47基因的正向引物tp47-f、反向引物tp47-r和荧光探针tp47-p，以及rnasep基因的正向引物rnasep-f、反向引物rnasep-r和荧光探针rnasep-p；所述引物和探针的序列如下：
2.如权利要求1所述一种梅毒螺旋体tp47 mrna逆转录一步法实时荧光pcr检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒中还含有：pcr反应液、酶反应液、标准品和对照品；
3.如权利要求2所述一种梅毒螺旋体tp47 mrna逆转录一步法实时荧光pcr检测试剂盒，其特征在于所述引物探针混合物中，引物的浓度为0.2μmol/l，荧光探针的浓度为0.2μmol/l。
4.如权利要求2所述一种梅毒螺旋体tp47 mrna逆转录一步法实时荧光pcr检测试剂盒，其特征在于所述标准品包括1.0×102copies/ml、1.0×103copies/ml、1...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑欣琪，童曼莉，林丽蓉，刘莉莉，庄江兴，杨天赐，
申请(专利权)人：厦门大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：
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