【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体涉及一种多酶共展示重组假单胞菌的构建方法和应用。
技术介绍
1、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)是最常用的聚酯塑料之一，性质稳定不易降解，在pet被广泛应用的同时，环境中积累的大量pet废料已经对生态系统造成了严重危害。
2、细胞表面展示技术是指通过重组dna技术，使外源功能蛋白表达并定位于特定细菌细胞的表面，以达到研究与应用目标的一项蛋白质应用技术。细胞表面展示体系由锚定蛋白、靶蛋白和受体菌三部分组成。细胞表面展示是通过将肽或蛋白质适当地融合到表面锚定基序上从而在微生物表面上显示肽或蛋白质。pet水解酶的表面展示系统和全细胞生物催化剂是酶表达和功能测定的新策略。通过dna重组，将pet水解酶基因克隆到细胞表面展示表达载体中，使pet水解酶通过锚定蛋白固定在微生物细胞表面，被展示的酶可保持较高的生物活性。通过构建pet水解酶基因工程菌将pet水解酶表达到细胞表面，不需要进行细胞破碎和酶的提取纯化，解决酶与底物不能直接充分接触以及在提取过程中活性损失等问题，增加了可重复利用性和稳定性。由于pet这种聚合物很难进入细胞，微生物细胞表面展示技术为pet的微生物降解提供了一种新对策。
3、假单胞菌pseudomonas sp.jy-q从废次烟叶水提液(tobacco waste extraction，twe)中分离而来，能够降解尼古丁，对尼古丁具有高度的耐受性，且能够耐受高渗透压的环境。目前对假单胞菌pseudomonas sp.jy-q的基因组信息以及遗传操作比较清楚，在本研究中将其选
技术实现思路
1、针对上述问题，本专利技术的目的在于提供一种多酶共展示重组假单胞菌的构建方法和应用。
2、具体采用如下技术方案：
3、本专利技术提供了一种表面展示fastpetase以及mhetase的假单胞菌，其以假单胞菌pseudomonas sp.jy-q作为底盘细胞，将带有信号肽、靶蛋白、锚定蛋白的基因序列的重组表达质粒导入所述底盘细胞后得到，所述fastpetase为改造后的聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶petase，fastpetase与mhetase均已进行密码子优化，锚定蛋白为假单胞菌jy-q的外膜蛋白ompa截断改造后的compa蛋白，信号肽为pseudomonas aeruginosa的外膜蛋白oprf(外膜蛋白f，outer membrane protein a)的信号肽signal(oprf)，将截断后的compa的信号肽替换为oprf的信号肽，将其命名为signal(oprf)-compa，作为表面展示的锚定蛋白。
4、作为一种优选的实施方式，所述重组表达质粒中表达fastpetase以及mhetase的质粒为组成型质粒p519n。
5、本专利技术提供了一种重组假单胞菌的构建方法，包括如下步骤：
6、1)以野生型假单胞菌pseudomonas sp.jy-q的全基因组为模板，pcr扩增得到锚定蛋白compa片段，其基因序列如seq id no.3所示；
7、2)以化学合成的，来自铜绿假单胞菌的锚定蛋白oprf的信号肽为模板，pcr扩增得到信号肽signal(oprf)片段，其基因序列如seq id no.4所示；
8、3)以p519n质粒为模板，pcr扩增得到锚定蛋白gfp片段；
9、4)选择xbai和ecori，作为酶切位点，将p519n质粒双酶切，按照takara dna片段纯化试剂盒步骤对终止反应液进行纯化回收获得双酶切后的质粒；
10、5)将步骤1)获得的锚定蛋白compa、步骤2)获得的signal(oprf)信号肽以及步骤3)获得的gfp片段和步骤4)的酶切p519n质粒一步克隆，获得信号肽替换后的锚定蛋白signal(oprf)-compa，pcr扩增得到signal(oprf)-compa片段；
11、6)编码fastpetase以及mhetase基因序列密码子优化后化学合成，pcr扩增得到目的蛋白基因片段，fastpetase的氨基酸序列如seq id no.1所示，mhetase的基因序列如seqid no.2所示；
12、7)将步骤5)和步骤6)中获得的片段和酶切后的质粒进行酶连，通过热激转化到大肠杆菌dh5α中，在含有卡那霉素的固体平板中筛选阳性转化子，即可获得重组表达质粒；
13、8)以步骤7)中获得的重组表达质粒经电转化导入到野生型假单胞菌pseudomonassp.jy-q的感受态细胞中，在含有卡那霉素的固体平板中筛选，获得重组假单胞菌。
14、本专利技术提供了上述重组假单胞菌在降解pet塑料污染物中的应用，将所述重组假单胞菌全细胞破碎后的粗酶液以及纯化后的蛋白用于降解聚酯型塑料，作为一种优选的实施方式，将所述重组假单胞菌进行扩培后，收集菌体并进行超声破碎，获得全细胞破碎后的粗酶液。
15、作为一种优选的实施方式，所述扩大培养的培养基为lb液体培养基。
16、作为一种优选的实施方式，在降解体系中，使用pbs作为降解培养基，以pet作为唯一碳源时添加量为4g；以bhet为唯一碳源时降解体系中底物浓度为200mg/l。
17、本专利技术的有益效果在于：
18、1)本专利技术获得了fastpetase以及mhetase在细胞表面展示表达的假单胞菌pseudomonas sp.jy-q，且镍柱纯化后获得的融合酶蛋白具有酯键水解酶活性；
19、2)本专利技术以假单胞菌pseudomonas sp.jy-q作为底盘细胞，构建能够降解pet的重组假单胞菌，为进一步土壤塑料污染的生物修复奠定基础。
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1.一种多酶共展示重组假单胞菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤8)中的感受态细胞的制备过程为：接种野生型假单胞菌Pseudomonas sp.JY-Q于培养基中扩培，控制OD600在0.60-0.80之间；移液枪吸取10mL菌液于预冷的无菌离心管中，4℃条件下，6000rpm离心3min；倒掉上清，加入5ml预冷的无菌水洗涤菌体2次；倒掉上清，加入5mL预冷的含有10％甘油的溶液吹打悬浮细胞，冰上静置5min，6000rpm离心3min，重复操作2次；倒掉上清，加入300μL预冷的10％甘油溶液，轻轻吹打混匀，每100μL分装至无菌1.5mL离心管中，保藏于-80℃冰箱或直接用于后续实验。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤7)的具体操作过程为：将重组表达质粒以及电转感受态细胞置于冰上解冻，取大1500ng重组质粒加入100μL解冻好的电转感受态细胞中，冰上静置10min，将电极杯预冷处理，然后加入混合液，冰上静置10min，选择1.50kv的电压，在电转仪中进行电转，电击结束后，加入1
4.一种采用如权利要求3所述的构建方法制备得到的重组假单胞菌在降解PET塑料污染物中的应用，其特征在于，包括如下步骤：将构建的重组假单胞菌接种于卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃过夜培养，磷酸缓冲液洗涤三次，超声破碎得到粗酶液，对细胞破碎液进行镍柱纯化，使用不同浓度咪唑的洗脱液洗脱目的蛋白，获得的粗酶液和纯酶液，并进行BHET降解实验，同样将构建好的的重组假单胞菌接入LB扩培，离心收集菌体，洗涤三次后接入PBS培养基中，加入PET粉末，37℃，180rpm摇床培养，培养七天，取样HPLC检测。
...【技术特征摘要】
1.一种多酶共展示重组假单胞菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤8)中的感受态细胞的制备过程为：接种野生型假单胞菌pseudomonas sp.jy-q于培养基中扩培，控制od600在0.60-0.80之间；移液枪吸取10ml菌液于预冷的无菌离心管中，4℃条件下，6000rpm离心3min；倒掉上清，加入5ml预冷的无菌水洗涤菌体2次；倒掉上清，加入5ml预冷的含有10％甘油的溶液吹打悬浮细胞，冰上静置5min，6000rpm离心3min，重复操作2次；倒掉上清，加入300μl预冷的10％甘油溶液，轻轻吹打混匀，每100μl分装至无菌1.5ml离心管中，保藏于-80℃冰箱或直接用于后续实验。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤7)的具体操作过程为：将重组表达质粒以及电转感受态细胞置于冰上解冻，取大1500ng重组质粒加入100μl解冻好的电转感受态细胞中，冰上静置10min...
【专利技术属性】
技术研发人员：钟卫鸿，孙梦，谢茜雅，朱佳宏，王俊杰，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
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