生物素化牛血清白蛋白和链霉亲和素酶标反应板及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种生物素化牛血清白蛋白和链霉亲和素酶标反应板及其制备方法，属于检验医学中标记免疫分析技术。本发明专利技术包括聚苯乙烯酶标板，而在每个微孔内分别包被有生物素化牛血清白蛋白和链霉亲和素；另将生物素化抗体液相保存作为反应试剂备用。检测时，将生物素化抗体与待测抗原同时加入到本发明专利技术酶标反应板上，生物素化抗体与待测抗原反应同时，生物素分子与链霉亲和素结合被固定在固相材料表面。本发明专利技术将待测抗原与生物素化抗体置于液相中，可提高反应速率，拓宽铁蛋白检测范围，减少双抗体夹心试验中的“钩状效应”。酶标反应灵敏度、准确度、精密度等指标均符合技术要求。提高包被抗体利用效率，减少抗体用量，大幅度降低试剂盒成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及酶联免疫分析技术，具体是一种包被生物素化牛血清白蛋白和链霉亲和素的酶标反应板及其制备方法。
技术介绍
酶联免疫吸附试验(Enzymelinked immunosorbent assay, ELISA)是以酶标记抗体(或抗原)及包被有抗体(抗原)的酶标反应板为主要试剂，将抗原抗体反应的特异性和酶催化底物高效性相结合的一种标记免疫分析技术。ELISA主要技术类型包括双抗体夹心法，间接法、竞争法、捕获法等。双抗体夹心法是常用技术之一，可用于检测体内微量物质。酶联免疫吸附试验属于非均相免疫分析，测定时需要分离结合标记物和游离标记物， 才能使检测信号与抗原抗体反应强度相关。一般采用固相吸附方式实现游离标记物分离， 测定结合标记物。即应用聚苯乙烯作为固相材料(微孔板，试管，微球)，通过非特异性吸附方式连接特异性抗体。如标本中含有相应抗原，必将与特异性抗体结合，形成免疫复合物同样被固定在固相材料表面，未结合物质游离于液相中，通过洗涤方式即可去除。双抗体夹心酶联免疫测定法，需要将捕获抗体与酶标反应板(96孔微量反应板)结合，形成预先包被抗体的酶标反应板，这一过程称为包被(即制备酶标反应板)。加入待测抗原和酶标抗体后，所形成免疫复合物通过酶标反应板上的捕获抗体固定在反应板表面，过剩的酶标抗体(以及其他非特异物质)存在于液相中，弃除反应液并洗涤反应板，便能除去没有结合的标记物(酶标抗体)。酶标反应板是酶联免疫分析重要材料，因此，制备酶标反应板是酶联免疫吸附试验关键环节。传统酶标反应板制备采用非特异性吸附技术。制备方法是将特异性抗体用包被缓冲液(磷酸盐或碳酸盐)稀释至一定浓度(3 10ng/L)，加入酶标反应板每个微孔中。由于聚苯乙烯具有吸附蛋白特性，能过物理(电荷)吸附抗体分子。经过一段时间后，抗体即被固定于固相材料表面，同时保留原有抗体活性。由于包被液中蛋白浓度很低，抗体分子不能完全覆盖所有位点，为防止后续反应时发生非特异性吸附，需再加入高浓度牛血清白蛋白 (bovine serum, albumin, BSA) (1%1%)，达到封闭空白位点目的。最后，弃除封闭溶液，经真空干燥包装即可。经典方法制备的酶标反应板是将抗体分子直接包被于酶标反应板表面，一般称为直接包被模式。直接包被模式具有操作简单、工艺成熟等优点。但是，直接包被模式存在诸多缺点，主要表现在如下方面其一，抗体分子被吸附在固相材料表面，由于抗原抗体反应依赖于空间构象，抗体固相化所导致的构象变化势必影响抗体的利用效率，导致抗原抗体之间亲和力的减低。其二、微量酶标板微孔内的表面积较小，导致包被抗体分子数量有限，加上固相化所导致利用率的降低，均会使抗体分子数量不能满足待测抗原的需求，影响试验方法的检测范围和检测时间。其三、固相化抗体分子处于静止状态，导致固相上抗体与液相中抗原的相碰撞几率永远小于液相反应，必然会增加抗原抗体反应达到平衡所需的时间。同时在一步法时，需同时加入待测抗原和酶标抗体，待测抗原与捕获抗体的反应速率小于待测抗原与酶标抗体的反应速率，导致“沟状效应”发生，出现假阴性结果。生物素(biotin，B)分子量为对4. 31，现已能人工合成，制备方便。生物素基本结构为双环结构1环为咪唑酮环，是与亲和素结合的部位；II为噻吩环，含一个戊酸侧链，其末端羧基可与生物大分子连接，形成生物素标记抗原、抗体、酶等。生物素与生物大分子结合后并不影响生物分子和生物素原有的生物活性，即生物素标记抗体同时具备与亲和素和相应抗原结合之特性。链霉亲合素(str印taVidin，SA)，分子量65KD，由四条相同的肽链组成，一个链霉亲合素分子能结合四个生物素分子。与亲和素相比，链霉亲和素对生物素具有高度亲和力(亲和常数为1015/mol)，与生物素结合后形成非常稳定复合物，很难解离。
技术实现思路
本专利技术就是为了解决经典直接抗体包被模式固有缺陷，提供一种以生物素化牛血清白蛋白、链霉亲和素为主要原料，利用生物素与链霉亲和素相结合的特性，而提供一种液相抗原和抗体反应方式，缩短反应达到平衡所需时间的生物素化牛血清白蛋白和链霉亲和素酶标反应板。本专利技术是按以下技术方案实现的。一种生物素化牛血清白蛋白和链霉亲和素酶标反应板，包括聚苯乙烯酶标板，而在酶标板的每个微孔内分别包被有稀释比例为1:2850-3150的生物素化牛血清白蛋白和稀释比例为1:3800-4200的链霉亲和素；另将生物素化抗体0. IM磷酸盐缓冲盐水4°C液相保存作为反应试剂备用。所述一种生物素化牛血清白蛋白和链霉亲和素酶标反应板，其酶标板的每个微孔内分别包被有稀释比例为1:3000的生物素化牛血清白蛋白和稀释比例为1:4000的链霉亲和素；另将生物素化抗体0. IM磷酸盐缓冲盐水4°C液相保存作为反应试剂备用。所述一种生物素化牛血清白蛋白和链霉亲和素酶标反应板的制备方法，包括聚苯乙烯酶标板，而在聚苯乙烯酶标板每孔加入生物素化牛血清白蛋白与稀释液I按 1:2850-3150比例稀释的生物素化牛血清白蛋白包被缓冲液150μ1，室温温浴16 18h，甩净包被缓冲液，用稀释液I洗酶标板2次，每次需静置lOmin，拍干；每孔再加入链霉亲和素与稀释液II按1 :3800-4200比例稀释的链霉亲和素包被缓冲液150μ1，常温温浴池，甩净包被缓冲液，用稀释液II洗酶标板2次，每次需静置lOmin，甩净稀释液II，最后每孔加入250μ1封闭溶液，4°C温浴过夜，甩净封闭溶液，真空干燥至少6h， 真空包装备用；另将生物素化抗体0. IM磷酸盐缓冲盐水，4°C液相保存作为反应试剂备用。所述生物素化牛血清白蛋白和链霉亲和素酶标反应板的制备方法，其稀释液I是由以下原料制备的，三羟甲基氨基甲烷5. 76-6. 36g氯化钠8. 33-9. 2IgProclin 3000.5ml蒸馏水950 ml调 pH=8. 0 加 0. 5 ml Procilin 300 定溶至 1000 ml。所述生物素化牛血清白蛋白和链霉亲和素酶标反应板的制备方法，其稀释液II是由以下原料制备的，磷酸二氢钠4. 45-4. 9Ig磷酸氢二钠6. 8-7. 52gL-色氨酸2. 09-2. Ig氯化钠8.33-9.21 g蒸馏水950 ml调 pH=8. 0定溶至 1000 ml。所述生物素化牛血清白蛋白和链霉亲和素酶标反应板的制备方法，其封闭溶液是由以下原料制备的，磷酸二氢钠0. 138-0. 152g磷酸氢二钠1. 38-1. 52g6-氨基己烷1.43-1.57g氯化钠4. 16-4. 6g蒸馏水 450 ml调pH=7. 3 7. 5 牛血清白蛋白1.9-2. Ig蔗糖16.63-18. 37gProcilin 3000. 25 ml加蒸馏水定溶至500 ml。所述生物素化牛血清白蛋白和链霉亲和素酶标反应板的制备方法，其生物素化抗体是将抗体与生物素以摩尔比为20:1的比例混合，室温搅拌lh，将反应后的液体经0. IM磷酸盐缓冲盐水透析后4°C保存备用。所述生物素化牛血清白蛋白和链霉亲和素酶标反应板的制备方法，其稀释液I是由以下原料制备的，三羟甲基氨基甲烷6.06 g氯化钠8. 77 gProclin 3000.5ml蒸馏水950 ml调 pH=8.本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种生物素化牛血清白蛋白和链霉亲和素酶标反应板，包括聚苯乙烯酶标板，其特征在于：酶标板的每个微孔内分别包被有稀释比例为１：２８５０－３１５０的生物素化牛血清白蛋白和稀释比例为１：３８００－４２００的链霉亲和素；另将生物素化抗体０．１Ｍ磷酸盐缓冲盐水４℃液相保存，作为反应试剂备用。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王洪，李会强，杨静，苑凤君，刘志勇，
申请(专利权)人：沃克天津生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：12