本发明专利技术公开了一种携NET‑1 siRNA的双功能肝癌靶向纳米微泡的制备方法，包括以下步骤：(1)合成3对NET‑1 siRNA序列，并使之生物素化；(2)制备生物素化纳米微泡；(3)合成生物素化半乳糖基化多聚赖氨酸；(4)通过生物素‑亲和素系统将上述步骤的生物素化NET‑1 siRNA、生物素化纳米微泡和生物素化半乳糖基化多聚赖氨酸偶联，即得携NET‑1 siRNA的双功能肝癌靶向纳米微泡。本发明专利技术的肝癌靶向纳米微泡不仅可以作为靶向超声对比剂用于临床超声诊断，同时更重要的是由于其携带的NET‑1siRNA具有抑制肿瘤生长作用而使得它还可以用于肝癌基因治疗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种纳米微泡的制备方法，具体涉及一种携NET-lsiRNA的双功能肝 癌靶向纳米微泡的制备方法，属于生物医学工程领域。
技术介绍
肝癌是威胁人类健康的一大杀手，被称为"癌中之王"。发病率呈逐年上升趋势，据 统计，每年全球肝癌发病率位居恶性肿瘤发病率的第五位，死亡率位居第三位，新患肝癌患 者中55%发生在中国。手术切除是其治疗的主要方法。然而，肝癌细胞生长迅速较早发生 血液转移，因此大多数患者失去了手术的机会。传统的放、化疗对其治疗效果也并不理想。 肝脏因其再生能力强、合成多种蛋白质等特点，已成为基因治疗的理想靶器官。 以往研宄显示，NET-1基因属于四次跨膜蛋白（TM4S)家族成员，在细胞信号转导、 调节、黏附、移动、增殖和分化中起重要作用，具有显著上调癌形成的作用。RNA干扰技术，是 指由与靶基因序列同源的短的双链RNA(siRNA)引发的广泛存在于生物体内的序列特异性 基因转录后的沉默过程。siRNA是一种小RNA分子（21?25核苷酸），由Dicer(RNAaseIII 家族中对双链RNA具有特异性的酶）加工而成。双链RNA经酶切后会形成很多小片段，称 为siRNA。siRNA只降解与其序列互补配对的mRNA。其调控的机制是通过互补配对而沉默 相应靶位基因的表达，所以是一种典型的负调控机制。 超声微泡既可以作为超声显像的造影剂，又可以作为药物或基因的载体，实现药 物和基因的靶向递送，是一种无创性、具有组织和器官特异性的药物运载工具。超声靶向照 射特定区域内的微泡，可使之破坏、爆破，释放其携带的药物或基因，使局部药物或基因含 量增多。 肿瘤血管由两部分组成，一部分是宿主固有的血管，在肿瘤生长的过程中，宿主局 部的微血管大部分被破坏，仅有动脉和较大的静脉可能保留下来，成为肿瘤血管系统的主 干，该部分血管通透性正常，其管壁的最大孔径不超过l〇〇nm;另一部分是肿瘤新生血管， 其结构不完善，基底膜不完整，管壁薄且缺乏平滑肌层，通透性明显升高，其管壁的最大孔 径约380?780nm，有时血管外的肿瘤细胞可直接与血管管腔相连。纳米级微泡可以有效的 通过孔径约380?780nm的血管壁进入肿瘤组织内部，更加高效的转运NET-lsiRNA。 本专利技术拟导入NET-lsiRNA，沉默NET-1的表达，从根本上抑制肝癌细胞的增长，起 到治疗肝癌的作用。以何种方式导入NET-lsiRNA是其能否高效发挥作用的首要前提，也是 肝癌基因治疗的核心问题。本专利技术专利技术人前期研宄发现低频超声联合微泡转染NET-lsiRNA 能够有效抑制肝癌细胞的生长，但基因转染效率有限。据此提出假设，应用超声联合靶 向载NET-lsiRNA纳米微泡治疗肝癌，将G-PLL作为靶向配体制备靶向纳米微泡，并将 NET-lsiRNA与其偶联，构成仅有纳米级大小的载基因复合物。该复合物在超声波的照射下 经过血管壁进入肿瘤细胞内，有效地解决siRNA在体内易降解、难以进入革巴细胞这一难题。 本专利技术专利技术人设想构建纳米级微泡造影剂作为NET-lsiRNA的载体，这样既可以 使治疗基因穿过血管内皮间隙进入肿瘤组织内部，同时在超声波的辐照下，利用空化效应 和声孔效应进一步提高肿瘤组织局部基因含量，提高基因转染效率，保护siRNA免受血液 循环中核酸酶的降解，提高治疗效果，此外这种纳米微泡还可以进行成像，使得纳米微泡既 可以作为治疗基因的载体又可以作为超声成像的造影剂，具有双重作用。 但一般纳米微泡对肿瘤组织的特异性较差，不能保证靶部位较高的SiRNA浓度， 提高基因治疗的靶向性。目前，关于靶向造影剂的制备方法包括两种，一种是通过靶向配体 与载体的静电吸附能力制备。另一种是以偶联"生物素（Biotin)-亲和素（Avidin)"的方 法制备。该纳米微泡表面通过氨基聚乙二醇偶联生物素，再与亲和素修饰的生物素化靶向 分子特异性结合，构成靶向纳米微泡。本专利技术利用半乳糖基化多聚赖氨酸（G-PLL)能与肝 癌细胞的ASGP-R特异性结合的特性，制备肝癌细胞特异靶向性纳米微泡。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种携NET-lsiRNA的双功能肝癌靶向纳米微泡的制备方 法以及由该制备方法制备得到的携NET-lsiRNA的双功能肝癌靶向纳米微泡。 为了实现本专利技术的目的，本专利技术提供了如下技术方案： 一种携NET-lsiRNA的双功能肝癌靶向纳米微泡的制备方法，其特征在于，包括以 下步骤： (1)合成3对NET-lsiRNA序列，并使之生物素化：3对NET-lsiRNA序列分别为SEQ IDN0:1-SEQID勵:6所示，且均经？411荧光和生物素标记，得到生物素化册1'-1811?隱，冻 干分装，_20°C保存； (2)制备生物素化纳米微泡：将DSPC、DSPE-PEG2000 和DSPE-PEG2000-biotin溶 解于氯仿与甲醇混合溶液中，于旋转蒸发仪蒸干，加入PBS缓冲液，移液到离心管中，并将 离心管内的空气置换为惰性气体，震荡，超声破碎，静置，浮集上层微球即所制生物素化纳 米微泡； (3)合成生物素化半乳糖基化多聚赖氨酸：在弱碱性溶液中，在硼氢化钠作用 下，通过还原氨化法进行半乳糖与多聚赖氨酸共价连接，化学合成半乳糖基化的人工配体 G-PLL，利用透析袋对G-PLL反应液进行透析，并用Molish反应检测透析液中未反应的乳 糖，透析至Molish反应阴性，透析结束，透析液于干燥箱内干燥至白色结晶析出，得纯化的 配体G-PLL，将G-PLL与BNHS混匀后室温反应2小时，透析即得生物素化半乳糖基化多聚赖 氨酸； (4)通过生物素-亲和素系统将上述步骤的生物素化NET-lsiRNA、生物素化纳米 微泡和生物素化半乳糖基化多聚赖氨酸偶联，即得携NET-lsiRNA的双功能肝癌靶向纳米 微泡。 在本专利技术中，优选的，步骤⑵中所述DSPC、DSPE-PEG2000和 DSPE-PEG2000-biotin的质量比为9:0. 5:0. 5 ;所述氯仿与甲醇的体积比为2:1 ;所述蒸干 为真空状态下40°C蒸干；所述PBS缓冲液的pH值为7. 4,浓度为0. 15mol/L;所述惰性气体 为C3F8;所述震荡的时间为40s;所述超声破碎的条件为：于55°C下水浴20s，停止破碎，同 样温度孵育60min，之后继续破碎2min。 在本专利技术中，优选的，步骤（3)中所述多聚赖氨酸、半乳糖和硼氢化钠的质量比 为1. 29:5. 36:3. 35 ;所述还原氨化法的反应条件：37 °C恒温反应24小时后，将反应液调至pH8. 5, 37°C继续反应6小时；所述干燥为70°C恒温干燥；所述G-PLL和BNHS混合时的摩尔 比为BNHS:G-PLL>20。 在本专利技术中，优选的，步骤（4)中所述制备携NET-lsiRNA的双功能肝癌靶向纳米 微泡的具体步骤为： ①吸取制备好的生物素化纳米微泡，加入过量的链酶亲和素，轻微吹打使其混匀， 37°C下反应30min，制成溶液1 ; ②将生物素化半乳糖基化多聚赖氨酸用无菌双蒸水调整至浓度lmg/mL后，逐滴 加入溶液1中，直至生物素化半乳糖基化多聚赖氨酸溶液过量。轻微吹打使其混匀，37°C下 反应30min;离心，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种携NET‑1 siRNA的双功能肝癌靶向纳米微泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)合成3对NET‑1 siRNA序列，并使之生物素化：3对NET‑1 siRNA序列分别为SEQ ID NO:1‑SEQ ID NO:6所示，且均经FAM荧光和生物素标记，得到生物素化NET‑1 siRNA，冻干分装，‑20℃保存；(2)制备生物素化纳米微泡：将DSPC、DSPE‑PEG2000和DSPE‑PEG2000‑biotin溶解于氯仿与甲醇混合溶液中，于旋转蒸发仪蒸干，加入PBS缓冲液，移液到离心管中，并将离心管内的空气置换为惰性气体，震荡，超声破碎，静置，浮集上层微球即所制生物素化纳米微泡；(3)合成生物素化半乳糖基化多聚赖氨酸：在弱碱性溶液中，在硼氢化钠作用下，通过还原氨化法进行半乳糖与多聚赖氨酸共价连接，化学合成半乳糖基化的人工配体G‑PLL，利用透析袋对G‑PLL反应液进行透析，并用Molish反应检测透析液中未反应的乳糖，透析至Molish反应阴性，透析结束，透析液于干燥箱内干燥至白色结晶析出，得纯化的配体G‑PLL，将G‑PLL与BNHS混匀后室温反应2小时，透析即得生物素化半乳糖基化多聚赖氨酸；(4)通过生物素‑亲和素系统将上述步骤的生物素化NET‑1 siRNA、生物素化纳米微泡和生物素化半乳糖基化多聚赖氨酸偶联，即得携NET‑1 siRNA的双功能肝癌靶向纳米微泡。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：程文，吴博林，
申请(专利权)人：哈尔滨医科大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。