本发明专利技术提供一种食物特异性IgE检测试剂盒及其制备方法。所述试剂盒包括测试反应板，测试反应板上设有金标垫和作为固相载体的NC膜。所述试剂盒还包括独立于测试反应板的多种生物素标记的变应原；所述金标垫含有胶体金标记的鼠抗人IgE单克隆抗体；所述NC膜上设有包被了生物素标记牛血清白蛋白的检测区和包被了羊抗鼠IgG多克隆抗体的质控区；所述生物素标记牛血清白蛋白上结合有链霉亲和素。本发明专利技术可根据患者具体情况进行“个性化”组合检测、操作简单，并且能够短时间获得检测结果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于临床检验诊断学领域，是一种利用胶体金免疫层析技术和生物素-链霉亲和素系统所建立的。
技术介绍
I.特异性IgE检测的临床价值变态反应(allergy)又称为超敏反应(hypersensitivity)是指已被抗原致敏的机体，当再次接触相同抗原时所发生的一种异常或病理性免疫应答，表现为生理功能紊乱和(或)组织损伤。引起变态反应的抗原称为变应原(allergen)。变态反应造成组织损伤或功能紊乱引起临床表现、病理症状，此类疾病称为变态反应性疾病。由免疫球蛋白E(IgE)介导的，肥大细胞核和嗜碱性粒细胞参与的变态反应称为I型超敏反应(也称为过敏反 应)。吸入变应原(花粉)常引起过敏性哮喘或鼻炎等呼吸系统疾病，食入变应原(蛋、奶)常引起肠炎等消化系统疾病，不仅如此，严重过敏反应也可引起全身症状(休克)。流行病学显示食物过敏反应主要由蛋、奶、海产品等八种主要食物引起，食物过敏反应的人群在逐年增多。特异性IgE(specific IgE，slgE)指针对某一种特定变应原的IgE。绝大多数过敏患者血清中均会检测到特异性IgE，如对牛奶过敏者则有针对牛奶变应原的SlgEjfa螨过敏者则有针对尘螨的SlgE。临床医学方面检测血清SlgE主要用于寻找和确定变应原。通常情况下①当临床病史非常典型或不适宜作皮试时，可直接进行slgE检测。②常规吸入或食物变应原皮肤试验阳性，且检测到相应变应原slgE，如病史、皮试和slgE均相符，则可确定变应原。因此，与总IgE相比，slgE具有更重要的临床价值。2.特异性IgE的检测方法特异性IgE采用免疫化学法(用已知抗原检测未知抗体)。以固相材料包被已知变应原(抗原)；如血清中存在相应的IgE分子，会与固相材料表面的变应原结合形成免疫复合物；加入标记第二抗体(抗人IgE)，标记抗体与复合物中IgE结合，形成固相变应原-特异性IgE-抗人IgE标记抗体。游离标记物通过洗涤方式除去，最终通过检测标记物，实现slgE的检测。从方法学角度分析，用于slgE测定的方法主要包括放射性过敏原吸附试验、间接酶联免疫吸附试验、酶免疫斑点印迹试验和荧光酶标法。目前，国内主流检测方法有酶免疫斑点印记试验和荧光酶免疫法，两种方法均为进口试剂，检测成本很高。酶免疫斑点印迹法以硝酸纤维素膜(NC)为固相载体，将多种变应原(如食入过敏原鱼、虾、蛋、奶、大豆、花生等)分点固定在测试条不同区域；将待检血清稀释合适浓度，与测试条共同置于反应槽内温育，血清中特异性IgE与固相载体表面的相应变应原结合形成免疫复合物；加入酶标记抗人IgE标记抗体,标记抗体与特异性IgE结合；反复冲洗去掉游离标记物，加入酶底物显色，通过NC膜表面的显色带，判断血清中特异性IgE抗体。荧光酶免疫法利用一个称为CAP的“帽状”结构塑料材料作为固相载体，吸附常见的多种变应原，形成包被抗原。加待测血清及不同浓度的标准品，血清中特异性抗体与相应变应原结合；再加上3半乳糖苷酶标记的抗人IgE，与固相表面特异性IgE结合(变应原-特异性IgE-抗IgE标记抗体)；加入的底物4-甲基伞形酮-P -半乳糖苷使之产生荧光。用荧光分光光度计读取吸光值，荧光强度与slgE呈线形关系。据此可绘出标准曲线，得出待测血 清中slgE的量。3.食物特异性IgE检测的特殊性和现有检测方法的缺陷与吸入性变应原相比，食入性变应原相对简单，临床医生往往根据病史可初步判定过敏性食物，也就是说对于特定的患者而言，临床医生只需要检测一种(或几种)可疑变应原。但是，不同患者疑似过敏食物不同，检测对象(或组合)并不相同。因此，临床需要一种个性化组合的食物变应原确定(特异性IgE)检测试剂盒。当然，对于门诊病人同样要求简单、快速。然而，现有食物过敏原(特异性IgE)检测试剂盒，无论是荧光酶免疫法还是酶免疫印记法，均不能满足临床的上述愿望。现有商品化试剂盒常常由生产厂家将多种变应原预先包被于固相材料表面，形成特定检测组合，不能根据患者的具体需要进行“个性化”选择。此种测定模式不仅增加患者就医成本，而且，也浪费宝贵医学资源。另一方面，无论是荧光酶免疫法，还是酶免疫印迹法，由于复杂操作过程和较长反应时间，使整个检测过程一般需要3-4小时。如此长的检测时间，使患者不能在短时间内拿到检测报告。患者需要择日取报告，再次就医。对于初诊患儿如医生怀疑某种食物过敏，往往需要快速实验室诊断，此时只需快速筛查进行排除或初步确认，而现有商品化试剂盒不能满足临床或患者的这一要求。
技术实现思路
本专利技术要解决的问题是提供一种简单、快速(10分钟)、并可根据患者具体情况选择不同食物特异性IgE的组合方式进行检测的食物过敏原(特异性IgE)检测试剂盒，以解决现有商品化食物过敏原(特异性IgE)检测试剂盒，不能根据患者具体情况进行“个性化”组合检测、以及操作时间长，不能在短时间获得检测结果等问题。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是一种食物特异性IgE检测试剂盒，包括测试反应板，测试反应板上设有金标垫和作为固相载体的NC膜，所述试剂盒还包括独立于测试反应板的多种生物素标记的变应原；所述金标垫含有有胶体金标记的鼠抗人IgE单克隆抗体；所述NC膜上设有包被了生物素标记牛血清白蛋白的检测区和包被了羊抗鼠IgG多克隆抗体的质控区；所述生物素标记牛血清白蛋白上结合有链霉亲和素。本专利技术试剂盒结构与原理示意图如图I所示，试剂盒的作用过程如下I、将提取的食物蛋白作为已知抗原，分别标记生物素制备得到生物素标记的变应原(已知抗原)，生物素标记变应原不直接包被固相载体(NC膜)，而是作为瓶装诊断试剂供检测对象选择；2、将鼠抗人IgE单克隆抗体标记胶体金颗粒，制备成胶体金标记抗体，胶体金标记抗体能够与人IgE结合形成免疫复合物，呈现紫红色；3、分别将生物素标记牛血清白蛋白(BBC)和羊抗鼠IgG多克隆抗体吸附在NC膜的检测区(T)和质控区(C)，其中再让BBC与链霉亲和素(SA)结合。如此，可确保检测区富集标记生物素的生物分子，质控区结合标记有胶体金的鼠抗人IgE单克隆抗体。4、检测时，选择一种生物素标记的变应原(如牛奶变应原)，与稀释的待检血清混合后，滴加在测试反应板的加样孔处，如果待测血清中含有针对牛奶的特异性IgE，特异性IgE与生物素标记牛奶结合形成免疫复合物，该复合物随层析流迁移至胶体金标记抗体所在位置的金标垫时，将胶体金标记抗体溶解并与之发生特异性结合，形成生物素抗原-特异性IgE-金标鼠抗人IgE三分子复合物。当此复合物迁移至检测区时，生物素分子与链霉亲和素结合，三分子复合物被富集在检测区并呈现紫红色。同时，游离胶体金标记抗体(过剩)迁移至质控区时，NC膜表面的羊抗鼠IgG多克隆抗体与胶体金标记抗体(鼠IgG)结合，形成免疫复合物并呈现紫红色。如果待检标本中不存在针对牛奶的特异性IgE，即使形成IgE-金标抗体复合物，因为复合物没有生物标记抗原，不能被检测区的链霉亲和素捕获，检测区无紫红色条带出现。优选的，所述多种生物素标记的变应原包括牛奶变应原、鸡蛋变应原、虾变应原、蟹变应原、花生变应原、黄豆变应原、腰果变应原和小麦变应原这八种常见食入性变应原。 优选的，所述生物素标记的变应原的蛋白浓度为8-12微克/毫升，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种食物特异性IgE检测试剂盒，包括测试反应板，测试反应板上设有金标垫和作为固相载体的NC膜；其特征在于：所述试剂盒还包括独立于测试反应板的多种生物素标记的变应原；所述金标垫含有胶体金标记的鼠抗人IgE单克隆抗体；所述NC膜上设有包被了生物素标记牛血清白蛋白的检测区和包被了羊抗鼠IgG多克隆抗体的质控区；所述生物素标记牛血清白蛋白上结合有链霉亲和素。
【技术特征摘要】
1.ー种食物特异性IgE检测试剂盒，包括测试反应板，测试反应板上设有金标垫和作为固相载体的NC膜；其特征在于所述试剂盒还包括独立于测试反应板的多种生物素标记的变应原；所述金标垫含有胶体金标记的鼠抗人IgE单克隆抗体；所述NC膜上设有包被了生物素标记牛血清白蛋白的检测区和包被了羊抗鼠IgG多克隆抗体的质控区；所述生物素标记牛血清白蛋白上结合有链霉未和素。2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述多种生物素标记的变应原包括牛奶变应原、鸡蛋变应原、虾变应原、蟹变应原、花生变应原、黄豆变应原、腰果变应原和小麦变应原。3.根据权利要求I或2所述的试剂盒，其特征在于所述生物素标记的变应原的蛋白浓度为8-12微克/毫升；所述胶体金标记的鼠抗人IgE单克隆抗体的蛋白浓度为3-9微克/毫升；所述生物素标记牛血清白蛋白的蛋白浓度为10-20微克/毫升；所述羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为5-10微克/晕升；所述链霉未和素的浓度为12-22微克/晕升。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述生物素标记的变应原的蛋白浓度为10微克/晕升；所述胶体金标记的鼠抗人IgE单克隆抗体的蛋白浓度为5微克/晕升；所述生物素标记牛血清白蛋白的蛋白浓度为15微克/毫升；所述羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为8微克/毫升；所述链霉亲和素的浓度为20微克/毫升。5.ー种制备权利要求1-3任一项所述的试剂盒的方法，其特征在于包括如下步骤 (1)制备生物素标记的变应原 1)将常规方法纯化好的食物变应原测定蛋白浓度并调整为5-10mg/ml，置于0.1M，PH9. 5的NaHCO3缓冲液中，透析、过夜，并用紫外吸收法測定蛋白浓度，计算蛋白总量，得蛋白溶液； 2)将活化的生物素溶于ニ甲基甲酰胺中，按照生物素与变应原的摩尔比为(18-22) I的比例，优选20 1，将生物素滴加入蛋白溶液中，全加入后室温搅拌条件下继续反应Ih ； 3)将反应后的液体用0.OlM pH7. 4磷酸缓冲盐水溶液于4°C透析24小吋，充分除去未结合的生物素，即制成生物素标记的变应原； (2)制备胶体金标记的鼠抗人IgE单克隆抗体； (3)用常规方法制备N...
【专利技术属性】
技术研发人员：李会强，常艳敏，彭志军，单立新，
申请(专利权)人：沃克天津生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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