增强鲁米诺体系的电化学发光生物传感器的制备方法技术

增强鲁米诺体系的电化学发光生物传感器的制备方法，属于生物传感器制备领域。本发明专利技术步骤：1)确定待检测的目标miRNA，并根据序列遵循碱基互补原则设计DNA探针序列；2)通过电化学循环伏安法，在玻碳电极表面电沉积金纳米颗粒，并将设计的DNA探针(5’端修饰巯基)通过金硫键连接到金纳米颗粒上；3)使用葡萄糖氧化酶封闭电极表面的非特异性结合位点；4)将目标miRNA与封闭后的电极反应，与DNA探针杂交后形成双链复合物；5)在杂交后的电极上滴加血红素溶液，该物质只嵌入miRNA‑DNA双链之间，可有效加速过氧化氢的分解并生成超氧阴离子，从机理本质上实现电化学发光的增强。本发明专利技术解决了鲁米诺体系发光信号弱，生物传感器检测灵敏度低的问题。

Enhance the preparation method of electrochemical biosensor system of luminol luminescence

Enhance the preparation method of electrochemical biosensor system of luminol luminescence, which belongs to the field of preparation of biosensor. The invention comprises: 1) to determine the detection of target miRNA, and follow the principle of design according to the sequence of bases DNA probe complementary sequence; 2) by cyclic voltammetry at a glassy carbon electrode surface electrochemical deposition of gold nanoparticles, DNA probe and design (5 'end modified thiol) through disulfide linked to gold gold nanoparticles; 3) blocking non-specific binding sites on the surface of electrode using glucose oxidase electrode reaction; 4) will target miRNA and closed after the formation of double chain complexes with DNA probe hybridization; 5) on the electrode after hybridization on adding heme solution, between the material only embedded miRNA DNA double the chain, which can accelerate the decomposition of hydrogen peroxide and superoxide anion generation, realize the electrochemical luminescence enhancement mechanism from the essence. The invention solves the problem that the luminous signal of the Lumino system is weak and the detection sensitivity of the biosensor is low.

【技术实现步骤摘要】
增强鲁米诺体系的电化学发光生物传感器的制备方法
本专利技术涉及一种基于增强鲁米诺体系电化学发光信号，构建用于检测miRNA生物传感器的新方法，属于生物传感器制备领域。该方法可应用于miRNA临床诊断以及对miRNA的定量分析。
技术介绍
MicroRNAs(miRNAs)是一类含有19—23个碱基的非编码单链小分子RNA，广泛存在于人体和几乎所有模式生物的细胞中，这些小分子RNA通过碱基配对与信使RNA(mRNA)序列的3′UTR区或编码区结合从而调控靶基因的表达，在动植物的发育、细胞生长分化和凋亡、代谢等生命活动过程中发挥重要的调控作用。最近有研究结果表明，miRNA的异常表达与多数癌症相关，如胰腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌和卵巢癌等。这些miRNA所起的作用类似于抑癌基因和癌基因的功能。因此，对细胞或组织样本中miRNA的定量检测将有利于人们进一步了解miRNA的表达与癌症发生之间的关系。miRNA也有望被用作有价值的标志物，用于早期的癌症诊断和预后，这对与探索生物进化及防治人类疾病具有重要意义。由于miRNA序列短、在细胞内的表达水平比较低，而且许多同源miRNA(如let-7家族)序列相似度高，仅差1—2个碱基，使设计的分析探针与miRNA杂交的效率低。所以，miRNA的研究给分析化学在检测的灵敏度和选择性方面都提出了新的挑战。当前，miRNA的检测方法主要有Northern印迹、微阵列芯片、聚合酶链式反应(PCR)扩增和原位杂交,但是因为操作繁琐、耗时长、灵敏度低等缺点这些传统方法在应用上受到限制。近年来，为了提高miRNA检测的灵敏度，多种DNA扩增技术如恒温滚环扩增技术等相继被应用于miRNA分析；为了提高miRNA的检测通量，相继开发了多种探针标记技术以及检测新方法。本实验中采用的检测信号是电化学发光(ECL)信号。ECL是在电极上施加一定的电压使电极反应产物之间或电极反应产物与溶液中某组分进行电化学反应而产生的一种光辐射。它包括了电化学分析和化学发光分析两个进程，因此既保留了化学发光方法灵敏度高、线性范围宽、观察方便和仪器简单等优点；同时增加了许多化学发光方法无法比拟的优点,如重现性好、试剂稳定、控制容易，从而引起人们的注意并得到了广泛的应用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种基于增强鲁米诺体系ECL信号，用于miRNA检测的生物传感器制备方法。此方法从电化学发光的反应机理出发，利用血红素作为辣根过氧化物类似物，可有效催化过氧化氢的分解的特性，在本质上实现了鲁米诺体系电化学发光信号的增强，从而更灵敏地检测目标miRNA。该方法灵敏度高、特异性强、检测成本低。本专利技术采取如下技术方案：1.增强鲁米诺体系的电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)确定待检测的目标miRNA，设计与其碱基互补的DNA探针序列；2)玻碳电极的预处理：打磨玻碳电极，超声清洗，氮气吹干后将电极浸入5mM氯金酸溶液中，通过循环伏安法，初始电压和低电位设置为0V，高电位为1V，在此区间内循环扫描电沉积金纳米颗粒；3)将DNA探针溶液滴加在电极表面，室温下于湿盒中自组装16-20h，带有巯基修饰的探针通过Au-S键固定到金纳米颗粒表面；4)滴加葡萄糖氧化酶封闭电极表面非特异性活性位点，于4℃下培育3h；5)将目标miRNA滴加到电极表面，室温下杂交30min，形成miRNA-DNA双链结构；6)将血红素溶液滴加到杂交后的电极表面，室温下培育1h。2.进一步，设计的DNA探针自身不会杂交。3.进一步，所用玻碳电极的直径是3mm，打磨粉为0.05μmAl2O3粉末。4.进一步，电沉积过程中的扫速为50mV/s，扫描圈数为5圈。5.进一步，滴加的DNA探针溶液由PBS缓冲液配置，浓度为25μM，体积为10μL；PBS缓冲液浓度为5mM，PBS的pH＝7.4，6.进一步，滴加的葡萄糖氧化酶浓度为0.5mg/mL，体积为10μL。7.进一步，滴加的血红素溶液浓度为10μM，体积为10μL。优选的是，设计的DNA探针自身不会杂交缠绕，不会形成发卡或者其他结构，相关检测干扰达到最低。优选的是，DNA的储备液是由PBS缓冲液配置，浓度为5mM，pH＝7.4。优选的是，目标miRNA与电极表面的DNA探针杂交时间为30min。优选的是，滴加在电极表面的血红素溶液浓度为10μM。优选的是，血红素嵌入miRNA-DNA双链复合物反应时间为1h。优选的是，测试电化学发光信号时，电解液中葡萄糖浓度为1×10-2M。优选的是，电沉积金纳米颗粒过程所设置的初始电位以及低电位为0V，高电位为1V，扫描圈数为5圈，扫速为50mV/s。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点和良好效果：1)利用血红素可催化H2O2分解生成超氧阴离子的特性，结合鲁米诺电化学发光机理，从本质上实现了鲁米诺的ECL信号的增强，并用于miRNA的检测。2)高特异性：因血红素与miRNA-DNA之间结合形式为嵌入作用，对于其他miRNA，其杂交效率要远远小于目标miRNA，因此结合的血红素数量大大降低，导致最终测得ECL增强效果明显不同。3)高灵敏度：鲁米诺自身发光效果较低，结合血红素的增强作用后，对于不同浓度目标miRNA可灵敏响应。4)无污染：整个检测过程不需要用到有毒试剂。附图说明图1为本专利技术基于增强鲁米诺体系电化学发光信号的生物传感器制备的示意图。图2为三种不同修饰状态电极所测得的ECL信号比较图。图3为本专利技术设计的生物传感器对于目标miRNA实现高特异性检测图。具体实施方式为了使本专利技术的内容、目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合说明书附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本领域内的技术人员所熟知的一般替换也涵盖在本专利技术的保护范围内。基于增强鲁米诺体系电化学发光信号的生物传感器制备，包括以下步骤：1)确定待检测的目标miRNA，遵循碱基互补原则，设计与其互补的DNA探针序列。2)玻碳电极的预处理：打磨玻碳电极，超声清洗，氮气吹干。将电极浸入5mM氯金酸溶液中，通过循环伏安法，初始电压以及低电位设置为0V，高电位为1V，在此区间内电沉积金纳米颗粒。3)将10μLDNA探针滴加在电极表面，室温下于湿盒中自组装16-20h，5’端修饰巯基的探针从而通过Au-S键被固定到金纳米颗粒表面。4)滴加10μL葡萄糖氧化酶用于封闭电极表面的非特异性活性位点，于4℃下培育3h。5)将目标miRNA滴加到电极表面，室温下杂交，形成miRNA-DNA双链结构。6)将10μL血红素溶液滴加到杂交后的电极表面，以嵌入双链结构中。7)电极洗净后，在5mL含葡萄糖和鲁米诺的PBS溶液中测量电化学发光。实施例一1.DNA探针的设计选择的目标miRNA为let-7d，其碱基序列：5’-AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU-3’DNA探针序列为：5’-HS-CCACCACGAACTATGCAACCTACTACCTCT-3’其中，需要说明的是，设计的DNA探针序列中下划线部分为与目标miRNA互补序列。DNA探针自身不会缠绕在一起，不会形成发卡或者其他结构，结构最小自由能为零本文档来自技高网...

【技术保护点】
增强鲁米诺体系的电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)确定待检测的目标miRNA，设计与其碱基互补的DNA探针序列；2)玻碳电极的预处理：打磨玻碳电极，超声清洗，氮气吹干后将电极浸入5mM氯金酸溶液中，通过循环伏安法，初始电压和低电位设置为0V，高电位为1V，在此区间内循环扫描电沉积金纳米颗粒；3)将DNA探针溶液滴加在电极表面，室温下于湿盒中自组装16‑20h，带有巯基修饰的探针通过Au‑S键固定到金纳米颗粒表面；4)滴加葡萄糖氧化酶封闭电极表面非特异性活性位点，于4℃下培育3h；5)将目标miRNA滴加到电极表面，室温下杂交30min，形成miRNA‑DNA双链结构；6)将血红素溶液滴加到杂交后的电极表面，室温下培育1h。

【技术特征摘要】
1.增强鲁米诺体系的电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)确定待检测的目标miRNA，设计与其碱基互补的DNA探针序列；2)玻碳电极的预处理：打磨玻碳电极，超声清洗，氮气吹干后将电极浸入5mM氯金酸溶液中，通过循环伏安法，初始电压和低电位设置为0V，高电位为1V，在此区间内循环扫描电沉积金纳米颗粒；3)将DNA探针溶液滴加在电极表面，室温下于湿盒中自组装16-20h，带有巯基修饰的探针通过Au-S键固定到金纳米颗粒表面；4)滴加葡萄糖氧化酶封闭电极表面非特异性活性位点，于4℃下培育3h；5)将目标miRNA滴加到电极表面，室温下杂交30min，形成miRNA-DNA双链结构；6)将血红素溶液滴加到杂...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲁理平，刘畅，
申请(专利权)人：北京工业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11