本发明专利技术公开了一种DNA分子克隆快速连接载体构建方法及其涉及的DNA分子，该方法包括：人工合成一种可与质粒DNA一起永久扩增的具有发夹结构的DNA分子，该分子还包括DNA切刻内切酶识别序列和痘苗病毒拓扑异构酶Ib的识别序列；将所述DNA分子构建到部分消除了拓扑异构酶Ib识别序列和DNA切刻内切酶识别序列的载体的克隆区；用DNA切刻内切酶和痘苗病毒拓扑异构酶Ib对所得载体DNA分别进行处理后，制备成可快速连接载体。本发明专利技术适用于所有克隆载体和表达载体的构建，整个过程操作简单，快速，所制备的载体适合于任意来源的DNA分子的克隆，外源DNA分子可直接插入到载体中，简化了操作步骤，降低了成本，提高了工作效率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领 域，特别是涉及一种DNA分子克隆快速连接载体的构建方法及其涉及的DNA分子。
技术介绍
早期的DNA分子克隆采用化学裂解方法取得DNA分子片段并连接到载体质粒，无特异性。自从发现了DNA内切酶和专利技术了多聚酶链反应(PCR)技术，DNA克隆技术得到了革命性发展，大大加快了分子生物学研究的步伐。但是用PCR加内切酶、连接酶的克隆方法存在以下缺点1)连接酶连接需要的时间长(> 4小时)；2)受载体DNA和外源DNA的限制性内切酶酶切识别序列兼容性限制；3)载体(Vector)和插入片断(Insert)DNA的分别的限制性内切酶酶解、分离、纯化需耗时0. 5-2. 0天。Holton, T. A.和 Graham, M. ff. (1991)和 Marchuk, D 等人(1991)专利技术了“T-Acloning”方法。该方法使载体DNA3’端凸出I个“T”碱基，插入片段DNA3’端凸出I个“A”碱基，形成一对碱基互补的粘性末端，再经T4DNA连接酶连接完成DNA克隆。此一改进，使得DNA连接效率提高50倍以上。但该方法仍然依靠T4DNA连接酶，连接时间> 4小时才理想，且> 2kb以上的DNA片段连接效率低。1991-1994年间，一种不依赖DNA连接酶的重组连接法出现，但该法需要加长的PCR引物合成和其他的酶修饰步骤，未得到广泛应用。Cheng, C.和Shuman，S. (2000)发展了另一种不依赖DNA连接酶的重组连接法。该方法利用痘苗病毒拓扑异构酶(Vaccinia topoisomerase) Ib的特异性识别位点“CCCTT”，通过切开和再连接的原理将外源DNA插入质粒载体。其基本步骤是I)HindIII内切酶切开环状质粒，用T4DNA连接酶连接带有痘苗病毒拓扑异构酶Ib识别位点的双链寡核苷酸接头(Linkers) ；2)再用HindIII酶切消除空载体；3)纯化酶切产物；4)与另一适配寡核苷酸单链退火；4)与痘苗病毒拓扑异构酶Ib反应；5)反应产物经电泳纯化，去除切下的寡核苷酸断头和多余的酶；6)定量、加抗冻剂、分装，_20°C以下保存待用。拓扑异构酶克隆连接法速度快(5-10分钟完成连接反应)、操作简单、克隆率高。但Cheng和Shuman两人专利技术的载体制备方法的最大缺点是工艺步骤繁多、不定性因素多(如，两次寡核苷酸接头退火复性、T4DNA连接酶连接反应效率、空载体的比例、至少两次纯化)、不适于大容量制备等。
技术实现思路
鉴于以上缺陷，本专利技术的主要目的是利用痘苗病毒拓扑异构酶Ib和经改造过的载体DNA序列，提供一种一体化的、连续的、快速、稳定、便于质控的DNA分子克隆快速连接载体构建方法。为了达到以上目的，本专利技术采用的技术方案如下首先，本专利技术提供了一种可以与质粒DNA —起永久扩增的具有特殊结构的DNA分子，该DNA分子包含可形成DNA发夹(hairpin)结构的DNA序列，还包含DNA切刻内切酶(Nicking Endonuclease)识别序列和所示的痘苗病毒拓扑异构酶Ib的识别位点。所述发夹结构可以为完全和/或不完全发夹结构。本专利技术还提供一种DNA分子克隆用载体，该载体包含上述具有特殊结构的DNA分子，并且所述DNA分子能够随所述DNA分子克隆用载体DNA —起复制与扩增。本专利技术还提供一种DNA分子克隆快速连接载体构建方法，该方法包括如下步骤I)将包含有可形成DNA发夹结构的DNA序列、DNA切刻内切酶识别序列和痘苗病毒拓扑异构酶Ib的识别位点的DNA分子与载体克隆区一体化构建；2)将步骤I)所得产物转化大肠杆菌感受态细胞；·3)挑取步骤2)所得大肠杆菌克隆，大量繁殖，扩增质粒DNA;4)提取质粒DNA;5)加入DNA切刻内切酶处理；6)加入拓扑异构酶Ib处理；7)加入灭菌甘油，分装，冻存。所述步骤I)具体包括以下步骤a)人工合成一段所述包含有可形成DNA发夹结构的DNA序列、DNA切刻内切酶识别序列和痘苗病毒拓扑异构酶Ib的识别位点的DNA分子；b)选择出发载体质粒,对以pUC/pMBl复制起始序列衍生的载体质粒,尤其是pUCrep ori区域(所述pUC rep ori区域易被拓扑异构酶IB切断,形成不必要的异位插入)进行改造，消除相邻的拓扑异构酶Ib识别序列、DNA切刻内切酶的识别序列；c)将步骤a)所得DNA分子连接到步骤b)所得质粒载体的克隆区；对以pUC/pMBl复制起始序列衍生的载体，本专利技术列举了 SEQ ID NO :8 SEQ IDNO 10三种突变序列,但不限于此序列。上述DNA分子克隆快速连接载体构建方法中，可以免除中途或终末纯化步骤，但亦可增加中途或终末纯化步骤。上述DNA分子克隆快速连接载体构建方法中，在无需连接任何DNA适配序列的前提下，切刻内切酶消化后，经变性-退火处理形成发卡结构，从而满足拓扑异构酶Ib以双链为底物的条件，并在预定位置切除发夹化DNA，再连接的发夹片段(“hairpinized”DNAfragments)无法形成假阳性克隆。本专利技术仅依靠DNA切刻内切酶的位置调整和DNA发夹序列设置可形成I)单碱基凸出(single-base protruding)粘性末端载体(如 T-A cloning vector) ；2)平端克隆载体(blunt-end cloning vector) ；3)多喊基 5’-凸出定向克隆载体(5-prime protrudingdirectional cloning vector)。上述DNA分子克隆快速连接载体构建方法，适用于包括克隆载体和表达载体在内的所有类型的载体的制备，其中表达载体包括原核表达载体、真菌表达载体、昆虫表达载体、哺乳类动物表达载体或植物表达载体。本专利技术具有以下优点I、所述DNA分子克隆快速连接载体构建方法，整个过程操作简单，实验周期短，结果稳定，便于质控；2、所述载体适合于任意来源的DNA分子的克隆或表达，外源基因可直接通过一步克隆法插入到载体中，大大简化了操作步骤，降低了成本，提高了工作效率；3、用本专利技术方法制备的快速连接载体克隆外源DNA分子，阳性克隆率高达90% 100%，或实现“零背景”(无蓝斑)克隆。附图说明图I为本专利技术提供的一种具有特殊结构的DNA分子的一种发夹结构示意图；图2为本专利技术提供的单碱基凸出粘性末端载体DNA序列示意图；图3为本专利技术提供的平端克隆载体DNA序列示意图； 图4为本专利技术提供的多碱基5’ -凸出定向克隆载体DNA序列示意图。具体实施例方式以下结合具体实施例对本专利技术的技术方案进行进一步说明，但不作对本专利技术的限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本专利技术提供了一种可以与质粒DNA —起永久扩增的具有特殊结构的DNA分子，该DNA分子具有以下重要特征I、特征之一是可形成DNA发夹(hairpin)结构，图I显示了其一种发夹结构示意图，发夹结构的长度从5’ -CCCTT-3，或5’ -TCCTT-3，的3’ T算起(包含3’ T)为9-100个碱基对(Base-pairs)，发夹结构的数量至少I个，但可2个或大于2个，但本专利技术不局限于此一种，它本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种DNA分子，其特征在于，所述DNA序列包含可形成DNA发夹结构的DNA序列，还包含DNA切刻内切酶识别序列和痘苗病毒拓扑异构酶Ib的识别位点。
【技术特征摘要】
1.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA序列包含可形成DNA发夹结构的DNA序列，还包含DNA切刻内切酶识别序列和痘苗病毒拓扑异构酶Ib的识别位点。2.根据权利要求I所述的DNA分子，其特征在于，所述发夹结构为完全和/或不完全发夹结构。3.—种DNA分子克隆载体，其特征在于，所述载体包含权利要求I所述的DNA分子。4.一种DNA分子克隆快速连接载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤 1)权利要求I所述的DNA分子与载体克隆区的一体化构建； 2)将步骤I)所得产物转化大肠杆菌感受态细胞； 3)挑取步骤2)所...
【专利技术属性】
技术研发人员：李万海，李万浪，李万波，
申请(专利权)人：北京康来兴生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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