与黄瓜有毛基因紧密连锁的基因片段及用途制造技术

本发明专利技术公开了一种与黄瓜有毛基因紧密连锁的基因片段及用途，所述基因片段是SEQ?ID?No.1所述的序列。利用本发明专利技术的与黄瓜有毛基因紧密连锁的基因片段对构建的F2代分离群体和黄瓜种质资源进行有毛性状评价，其结果与表型鉴定符合率达100%，在黄瓜育种中进行资源有毛性状筛选和利用具有很大的应用价值。以这些序列为依据，可以进行有毛性状分子标记辅助选择、育种；可以为进行黄瓜有毛基因定位、作图与克隆，通过基因工程改良黄瓜品种的性状奠定基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物基因工程
，涉及黄瓜常规杂交育种、分子标记辅助育种的方法与技术，特别涉及与黄瓜有毛基因紧密连锁的基因片段。
技术介绍
1999年秋天在45株黄瓜育种材料中发现了 3株具“无毛”性状的突变体，遗传研究表明，无毛性状是由一对核基因控制的隐性性状，与曹辰兴(1999年)的研究结果相一致。黄瓜无毛突变体与普通黄瓜相比，幼苗的各种性状均没有明显变化，整株任何地方均无短刚毛，手感光滑，无扎手感觉，此特点在幼苗子叶展平时就可以与普通黄瓜苗区分。 黄瓜无毛突变体最早由Robinson和Mishanec (1964)报道(通过福射诱变产生)，表现为茎、叶、卷须、花萼、子房均没有表皮毛，果实表面也没有果刺和果瘤，并将该隐性突变基因命名为glabrous (gl)。Whelan (1973)、曹辰兴和郭红芸(1999)也先后发现黄瓜无毛突变体。Inggamer&Ponti (1980)报道的叶片无毛突变体(gl_2)黄瓜NCG-042表现为果柄、花柄、花萼上有稀疏的绒毛，果实上有稀少的果瘤，但是茎、叶及叶柄光滑无毛。研究表明，无毛基因对果瘤基因存在隐性上位作用，参与黄瓜果瘤的形成(曹辰兴等，2001 )。关媛(2008)利用棉花和拟南芥TTGl基因对黄瓜进行同源克隆，得到一个黄瓜TTGl-Iike基因——CsTTGl，功能验证表明CsTTGl可以互补拟南芥ttgl突变体的表型，但是表达分析证明引起gl突变的基因不是黄瓜TTGl-Iike基因。张弛等(2009)以曹辰兴和郭红芸发现的无毛突变体和普通有毛黄瓜为亲本，获得了两个与gl基因连锁的SRAP标记ME6EM5和ME230D15，遗传距离分别为3. 6cM和12. 9cM。苗晗等(2011)以黄瓜有毛野生类型‘9110Gt’ (Pl)和无毛突变体‘NCG-042’ (P2)(含有叶片无毛基因gl_2)为试材，明确了黄瓜的有毛、无毛性状(gl-2)由一对核基因控制，有毛对无毛为显性。并以F2为作图群体，构建了包含18个SSR标记的gl-2基因的SSR连锁群，并将该基因定位在黄瓜第2条染色体上，两侧最近的连锁标记为SSR10522和SSR13275，遗传距离分别为O. 6cM和3. 8cM。由于无毛性状是由一对核基因控制的隐性性状，非常适合作为形态标记、纯度鉴定的标记性状。因此，对黄瓜无毛性状的研究，特别是确定与黄瓜有毛基因紧密连锁的SSR片段对黄瓜生产和育种都具有重要的理论和实践意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种与黄瓜有毛基因紧密连锁的基因片段。本专利技术的第二个目的是提供一种与黄瓜有毛基因紧密连锁的基因片段的用途。本专利技术的技术方案概述如下一种与黄瓜有毛基因紧密连锁的基因片段，所述基因片段是SEQ ID No. I所述的序列。上述基因片段在对黄瓜种质资源进行有毛性状筛选或对黄瓜有毛性状进行分子标记辅助育种的用途。利用本专利技术的与黄瓜有毛基因紧密连锁的基因片段对构建的F2代分离群体和黄瓜种质资源进行有毛性状评价，其结果与表型鉴定符合率达100% (数据见表1)，在黄瓜育种中进行资源有毛性状筛选和利用具有很大的应用价值。以这些序列为依据，可以进行有毛性状分子标记辅助选择、育种；可以为进行黄瓜有毛基因定位、作图与克隆，通过基因工程改良黄瓜品种的性状奠定基础。附图说明图I是本专利技术的与黄瓜有毛基因紧密连锁的基因片段的获得图谱其中A(M)为指示DNA标准条带的Marker ^(P1)为母本F80有毛基因片段；1_5为有毛单株；6_10为无毛单株，M为DNA标准。图2是F80 XF80WM杂交后代F2代分离情况图谱其中A (M)为DNA标准；C为F2群体中有毛基因片段，I 32、42 53、78 93为有毛单株，33 41、54 77为无毛单株。 具体实施例方式本专利技术是在对黄瓜有毛亲本F80和无毛亲本F80WM及其杂交后代F1、F2、BC1群体进行人工观察鉴定，获得黄瓜无毛种质的基础上，采用SSR技术分离与黄瓜有毛基因连锁的基因片段，进行测序、分析，为种质资源的筛选、分子标记辅助育种奠定基础。为了实现以上目的，本专利技术采用SSR (Simple sequence repeat)分子标记技术，采用BSA法对黄瓜种质F80的有毛相关基因和黄瓜种质F80WM的相关基因进行了分子标记研究。获得与黄瓜有毛基因紧密连锁的基因DNA片段I个，对这个片段测序后，其大小为164bp (SEQ ID No. I所述的核苷酸序列)。本专利技术获得的与黄瓜有毛基因紧密连锁的基因序列的具体操作步骤如下I. F2分离群体的构建及表型鉴定利用黄瓜有毛亲本F80和无毛亲本F80丽杂交获得F1, F1自交获得F2。田间种植F2群体，正常管理。第2真叶时肉眼观察并借助显微镜观察F2单株分离情况。2. DNA提取及SSR分析体系剪取黄瓜幼嫩小叶，采用CTAB法单株提取DNA，_20°C保存。PCR 反应体系为 20 μ I，黄瓜基因组 DNA20ng、SSR 引物各 50ng、dNTPO. 2mM、Mg2+1. 5mM、l倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶I. 6单位；反应条件为94°C预变性300秒，94°C变性30秒，55 °C退火30秒，72 °C延伸60秒，35个循环，再72 °C延伸350秒。3. SSR弓丨物筛选和验证在抗感亲本间筛选1164对SSR引物和29对EST-SSR引物，在双亲间产生多态性的引物15对，其中引物SSRO1647在两亲本以及F2极端个体单株进行PCR扩增，获得了一个显性SSR标记，用该引物组合分别对组外的其它F2单株以及育种和生产上的有毛高代自交系进行扩增，进一步确认所筛选到的标记。结果表明有毛亲本和有毛单株扩增出164bp的特异片段，无毛亲本和无毛单株未扩增出该特异片段。经组外其余F2单株和育种自交系分析，所筛选到的标记与目标基因一黄瓜有毛性状相关基因紧密连锁，符合率为100%。所用SSR引物SSRO1647的碱基序列为Pl:5，-CACCCTCTCACTTGTAGCCC-3 丨(SEQ ID No.2)P2 5' -CGATCAGAAGGGGGAAAAA-3 ; (SEQ ID No. 3)4. PCR产物的回收和测序将扩增产物采用5%变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离；在扩增产物中加入变性凝胶上样缓冲液，于95°C变性300秒，上样于经30分钟预电泳的变性聚丙烯胺凝胶上，100W恒功率电泳至溴酚兰刚刚到达凝胶的另一端，凝胶经硝酸银染色后在可见光下观察。采用煮沸法将目的片段从银染胶上回收、扩增，送至北京三博远志生物工程公司进行测序。5.序列分析根据测序结果，与黄瓜有毛基因紧密连锁的特异片段有164个碱基(SEQ ID No. I·所示)。下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明。实施例I采用BSA法，以黄瓜有毛亲本F80和无毛亲本F80WM及其184株F1代分离群体为试材，采用CTAB法提取黄瓜基因组DNA。以1164对SSR引物和29对EST-SSR引物进行PCR扩增，根据特异DNA片段在F2代分离群体中的表现情况，对照以上的苗期人工表型鉴定结果，获得与黄瓜有毛基因紧密连锁的SSR标记SSR01647以及与有毛基因紧密连锁的DNA片段(SEQ ID本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种与黄瓜有毛基因紧密连锁的基因片段，其特征是所述基因片段是SEQ？ID？No.1所述的序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨瑞环，李淑菊，王惠哲，管炜，
申请(专利权)人：天津科润农业科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：