用于克隆载体的核酸制造技术

本发明专利技术涉及能够形成克隆载体的一部分或者设计用来插入克隆载体的一段核酸。所述核酸包含至少一个克隆和／或表达所需的功能核苷酸序列，并与至少一个识别Ⅱ型限制性内切酶（ＲＥⅡ）的序列相偶联，以使有关的ＲＥⅡ切割位点位于所述功能核苷酸序列之内。本发明专利技术还涉及一种使用所述核酸的方法。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及克隆载体上的或者适于插入克隆载体的核酸，核酸至少含有一段克隆和/或表达所需要的功能序列。克隆载体的特征是在载体的一段对载体增殖和宿主细胞生存均不重要的区域里含有一个限制性内切酶的单一切点。现有技术中，具有这些性质的原始克隆载体如质粒pBR322、pAT153等，几乎完全被含有连续排列的多重限制性内切酶切点的载体所替代，这种连续排列的切点被称为多克隆位点或多接头。这些多克隆位点/多接头经常被构建在多功能序列单元中，其中单元中还含有其它的功能序列，如RNA聚合酶的启动子序列，用于实现克隆的目标DNA片段(即插入载体的DNA片段)的转录；终止序列和多聚腺苷酸化信号或序列，其能够促进克隆的目标DNA片段表达的蛋白质的纯化。通常用于克隆的II型限制性内切酶(此后简称为REII)具有如下性质特异的DNA识别序列(通常为4到8个碱基对)同时也是其特异性的切割位点，而且这一识别序列相对于中心点对称，通常是一个回文结构，即，从两条链上读去时，从两个方向读出相同的序列，这就导致了分别切割不同的DNA序列时，独立与DNA源，产生相同的适配末端。REII的典型代表是EcoRI，其识别序列在两条链上均为6碱基序列5’GAATTC3’(回文结构)，切割点是双链DNA每条链的沿5’到3’方向的G之后A之前 当拼接同为EcoRI切开的克隆载体(大写字母)与待克隆的目标DNA片段(小写字母)时，该酶的识别序列暨切割位点会再生，尤其是分别在目标DNA片段的两端。 显然不仅对EcoRI如此，对所有的具有回文识别序列和切割位点的REII都是如此。当要把几个具有相同末端的目的DNA片段按指定顺序克隆入载体时，REII就显出了缺点。由于克隆进第一个目的DNA片段后，REII的识别序列和切割位点再生了两次，即在DNA片段的两端都再生了，而在后续切割中，就不可能特异地切开两个切点中的某一个以插入第二个目标DNA片段。在这种情况下，本领域的技术人员通常会尝试进行部分酶切。但是，这种方法会产生不希望的切割产物，进而产生不希望的克隆产物。基于REII的传统克隆方法的原理如“图1”所示，其中灰色阴影代表不希望的克隆产物。从图1的示意图中可以看到，考虑到时间和投入的话，即便是克隆进第二个目标DNA片段时，寻找期望的正确克隆的产物都是效率低下的。当有3个、4个、甚至更多个目标DNA片段需要插入的话，即使本领域的技术人员使用一些诸如重叠PCR、双酶切等方法进行辅助，传统方法实际上仍是不可行的。现有技术中另有一组使用较少的限制性内切酶，是IIs型限制性内切酶(此后简称REIIs)。这类限制性内切酶与REII的区别有两点其一是识别序列(一般为4到8碱基对)通常不对称，因而也即不是回文结构；其二是其切割点和识别序列不一定相同，但通常切割点位于识别序列的一定距离之外。以下是几种可能的切割点位置和类型。a)DNA的两条链均在识别序列外一定的碱基距离处被切割(“外部切割酶”)现有技术中“外部切割酶”的典型例子是REIIs AarI。其识别序列为7碱基序列在DNA的一条链上为5’CACCTGC3’，在互补链上为5’GCAGGTG3’。切割点位于沿5’到3’方向识别序列5’CACCTGC3’之后的第四个和第五个碱基之间；另一条链上的切割点位于沿5’到3’方向识别序列5’GCAGGTG3’之前的第八个和第九个碱基之间。 b)切割在一条链上识别序列之外一定碱基距离处进行；另一方面，切割在识别序列内某一特定位置进行。(“部分外部切割酶”)现有技术中这样的例子是REIIs BseNI c)两条链上都在识别序列之内的特定位点被切割。现有技术中这样的例子是REIIs BssSI 另有一组尽管不属于REIIs，却与REIIs有相似的性质的限制性内切酶，特别是，称为“自引导核酸酶(homing nucleases)”。它们与REIIs的最显著区别(通常是实质性)是较长的识别序列，一般为8到20个碱基对。现有技术中已知“自引导核酸酶”的典型例子是I-HmuII酶(“外部缺刻酶”)，其识别序列为24个碱基。AGTAATGAGCCTAACGCTCAACAANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCATTACACGGATTGCGAGAAGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NN由于“外部缺刻酶”通常只在切割位点处切断一条链，通过组合使用至少两个这样的酶，可以产生一个新的有用的切点以裂解两条核酸链。当用“外部切割酶”或“外部缺刻酶”切割一段DNA时，所得到的DNA片断中有一段保留了完整的该酶的识别序列(而在类似情况下使用REII切割时，识别位点就破坏了)，而且切割产生的两个末端与其他DNA片段用同一个酶切割产生的末端通常是不匹配的，所以只能直接与自身的末端重新连接(直接互补)。正是因为如此，这些“外部切割酶”/“外部缺刻酶”不适用于“传统”的克隆，在其他领域至今也罕有应用。这种“外部切割酶”的不多的几个应用实例在“Fermentas AB(Vilnius，Lithuania)公司2000/2001目录中196/197页有记载。“外部切割酶”被用来切除PCR引物序列以得到适合定向克隆进传统载体的末端。现有技术中已有的用REIIs进行核酸分子引导合成的方法有几个缺点。很多方法都需要进一步的复杂的酶促反应，例如用聚合酶补平，用核酸酶对核酸中特定区域进行切割或修复，或用本领域技术人员熟悉的一些修饰酶对核酸进行修饰，例如用磷酸酶。此外，用已知方法通常不可能将多个核酸片段以定向的方式连接在一起。本专利技术的目的之一是为克隆和/或表达提供一个有用的功能序列区，当用REIIs拼接多个DNA片断时没有前述的缺点，同时避免了REIIs的非特异性切割。进一步的目的是提供一种不需复杂酶促反应的核酸合成方法。作为实现这些目标的一个解决方案，我们提供了一段核酸，位于克隆载体上或适于插入克隆载体的核酸上，其中核酸含有至少一段克隆和/或表达所需的功能核苷酸序列，其特征在于这一功能序列与至少一个REIIs或“自引导核酸酶”的识别序列相偶联，偶联使REIIs或“自引导核酸酶”的切割位点恰好位于此功能核苷酸序列之内。这段核酸使得本领域技术人员可以选择已存在的、相同的REII的识别序列中的至少一个和/或已存在的、其他单个或重复串联的功能序列中的至少一个，特别是此核酸可以为DNA或RNA。本文的术语“克隆和表达所需的功能核苷酸序列”特别包括所有类型的REII裂解位点，但也包括RNA聚合酶的启动子序列，REIIs的功能序列或“自引导核酸酶”本身以及其他本领域技术人员已知的具有特定功能的序列或部分序列，例如-启动子序列，增强子，沉默子，终止序列，多聚腺苷酸化序列(调节序列)-基因，开放读框-蛋白及RNP结合位点-用于纯化克隆片段的表达产物蛋白的序列此处文中术语“偶联”一词可以有如下含义-REIIs或“自引导核酸酶”的识别序列与切割位点均位于克隆和/或表达所需的功能序列区内，即，核酸序列中适于克隆入目的DNA片段的或有其他功能的部分序列，和-切割位点位于克隆和/或表达所需的功能序列区内，即核酸序列中的适于克隆入目的DNA片段的本文档来自技高网...

【技术保护点】
克隆载体中的一段核酸，或适合插入克隆载体的具有至少一个克隆和／或表达所需功能核苷酸序列的核酸片段，特征在于该核酸或至少一个功能核苷酸序列与至少一个ＲＥⅡｓ识别序列或“自引导核酸酶”识别序列相偶联，从而使相应的ＲＥⅡｓ或“自引导核酸酶”的切割位点位于功能核苷酸序列之内。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：莱茵哈德哈牙蒙，
申请(专利权)人：基因设计股份有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]