克隆载体制造技术

本发明专利技术提供一种TA克隆用载体、使用该载体的克隆方法、该载体的制造方法以及含有该载体的试剂盒，所述TA克隆用载体在以简便的方式控制PCR扩增产物之类的DNA片段的插入方向的同时，可容易地选择仅插入有目的DNA片段的克隆。本发明专利技术提供一种载体，该载体在其末端配置有核酸序列缺失了的活性丧失耐药性基因，其中所述核酸序列对在耐药性基因产物的耐药性发挥中不可缺少的C末端部分的氨基酸或N末端部分的氨基酸进行编码；本发明专利技术还提供使用该载体的克隆方法、该载体的制造方法和含有该载体的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
克隆载体
本专利技术涉及适于PCR产物克隆的载体、使用该载体的克隆方法、该载体的制造方法以及含有该载体的试剂盒。
技术介绍
迄今为止，作为目的基因的分离方法已知有利用PCR的方法。在该方法中，首先通过PCR扩增含目的基因的DNA或其片段，将得到的PCR产物组装到克隆用质粒载体中，进一步使用该质粒载体使宿主转化从而形成转化体的单菌落。接下来，由所形成的单菌落精制质粒，对插入到质粒中的DNA片段进行确认。通过这样做，可得到插入有目的基因或其片段的质粒。在PCR法所用的酶中，已知代表性的TaqDNA聚合酶中存在这样的副反应活性：在复制后的DNA产物的3′末端以非模板依赖性的方式添加1个脱氧腺苷(dA)残基。因此，使用存在这样副反应活性的DNA聚合酶扩增的双链DNA片段的大部分具有添加了1个脱氧腺苷残基的3′端突出结构。已开发了利用TaqDNA聚合酶并利用开环载体(T载体)的TA克隆法，其中所述开环载体在两个3′末端具有突出的1个脱氧胸腺嘧啶核苷(dT)残基(非专利文献1)。通过采用TA克隆法，可在不进行PCR产物的限制性酶处理和末端平滑化处理的情况下得到插入有PCR产物的重组质粒。然而，传统的TA克隆法存在缺点。在TA克隆中，在含有插入有PCR片段的质粒的转化体鉴别中，通常利用β-半乳糖苷酶基因的α-互补性，即，所谓的蓝白筛选。然而，有时存在以下情况：在相对于衍生自β-半乳糖苷酶的α肽基因的碱基序列通过读码框插入PCR片段时，引起作为融合蛋白的α肽的表达。在这种情况下，导致呈现弱蓝色的假阴性菌落的生成。另外，在通常的TA克隆法中，不能控制插入到载体中的目的基因的方向性。为了消除该缺点制作了改良型T-载体。例如，在专利文献1中披露了将生成第一限制性酶切位点的引物对与T-载体相组合的方法，其中这样设计所述T-载体：仅在使用所述引物对沿逆向插入PCR扩增产物时出现第二限制性酶切位点。在该方法中，使用切断第二限制性酶切位点的限制性酶仅切断沿逆向插入的质粒，由此可以仅得到这样的转化体：其保持有沿期望方向插入有DNA片段的质粒。然而在该方法中，连接反应之后需要进一步进行限制性酶处理，操作变烦杂。最近，有人报道了这样的方法：为了控制在TA克隆法中生成假阴性菌落，利用致死基因作为选择标记(非专利文献2)。然而，在该方法中，不能控制插入到载体中的目的基因的方向性。由以上可知，目前尚不存在这样的克隆载体，其简便地控制PCR扩增产物这样的DNA片段的插入方向，同时可容易地选择仅插入有目的DNA片段的克隆。现有技术文献专利文献专利文献1：国际公开第2005/021747号小册子非专利文献非专利文献1：BioTechniques，1995年，第19卷，第1期，第34-35页非专利文献2：MolecularBiologyReports，2009年，第36卷，第7期，第1793-1798页
技术实现思路
专利技术要解决的课题本专利技术的目的是提供克服了上述缺点的TA克隆用载体、使用该载体的克隆方法、该载体的制造方法以及含有该载体的试剂盒。解决课题的手段本专利技术人发现，借助于这样的载体可解决上述课题从而本专利技术完成，该载体在末端配置了核酸序列缺失的活性丧失耐药性基因，其中所述核酸序列对在耐药性基因产物的耐药性发挥中不可缺少的C末端部分的氨基酸或N末端部分的氨基酸进行编码。即，本专利技术涉及：[1]一种载体，其为由直链状双链DNA形成的克隆用载体，所述直链状双链DNA在两个3′末端具有突出的1个脱氧胸腺嘧啶核苷或尿嘧啶核苷残基，该载体的特征在于，其保持有对耐药性基因产物的部分序列进行编码的核酸，所述核酸为缺失了这样的核酸序列的活性丧失耐药性基因，该核酸序列对在所述耐药性基因产物的耐药性发挥中不可缺少的C末端部分的氨基酸或N末端部分的氨基酸进行编码，此外，所述核酸配置在所述双链DNA中任一者的末端，使得在将其中末端部分含有所述活性丧失耐药性基因中所缺失的核酸序列的插入DNA片段连接到载体时，构成了对没有缺失的耐药性基因产物进行编码的核酸。[2]上述[1]中记载的载体，其中，所述活性丧失耐药性基因为缺失了这样的核酸序列的活性丧失耐药性基因，该核酸序列对耐药性基因产物的C末端部分的氨基酸进行编码。[3]上述[2]中记载的载体，其中，所述活性丧失耐药性基因由对缺失了C末端氨基酸的β-内酰胺酶的氨基酸序列进行编码的核酸序列构成。[4]上述[3]中记载的载体，其中，所述活性丧失耐药性基因由对序列表的序列号17中记载的氨基酸序列进行编码的核酸序列构成。[5]上述[1]中记载的载体，还包括第2耐药性基因，所述第2耐药性基因示出与前述耐药性基因不同的对药剂的耐药性。[6]上述[1]中记载的载体，其由由序列表的序列号5中记载的核酸序列所形成的DNA和由序列表的序列号18中记载的核酸序列所形成的DNA形成。[7]一种克隆DNA的方法，包括以下步骤(a)～(d)：(a)以DNA为模板，使用第一引物、与第一引物相对的第二引物、以及DNA聚合酶进行PCR的步骤；(b)将通过步骤(a)得到的PCR产物与上述[1]至[6]中任一项记载的载体连接，得到环状DNA的步骤；(c)采用由步骤(b)得到的环状DNA对宿主细胞进行转形的步骤；以及(d)利用这样的药剂进行药剂选择，由此选择具有环状DNA的转化体的步骤，其中所述药剂是没有缺失的耐药性基因产物对其示出耐药性的药剂，并且所述环状DNA是通过将PCR产物沿期望方向插入载体中而成的；其中，第一引物在3′末端侧具有与前述DNA互补的核酸序列，并且当上述[1]至[6]中记载的载体中的活性丧失耐药性基因为缺失了对耐药性基因产物的C末端部分的氨基酸进行编码的核酸序列的基因时，所述第一引物在5′末端侧具有所缺失的核酸序列，当上述[1]至[6]中记载的载体中的活性丧失耐药性基因为缺失了对耐药性基因产物的N末端部分的氨基酸进行编码的核酸序列的基因时，所述第一引物在5′末端侧具有从所缺失的核酸序列的互补链序列脱除了5′末端的脱氧胸腺嘧啶核苷后的核酸序列。[8]上述[7]的克隆方法，其中步骤(a)中的DNA聚合酶具有在反应产物的3′末端以非模板依赖性的方式添加1个脱氧腺苷碱基的活性。[9]上述[7]的克隆方法，其中，在步骤(a)中还包括在反应产物的3′末端添加1个脱氧腺苷碱基的步骤。[10]一种载体的制造方法，包括下列步骤：通过限制性酶PmaCI切断具有序列表的序列号19中记载的核酸序列的环状双链DNA的步骤，以及通过具有末端脱氧核苷酸转移酶活性的酶在切断后的双链DNA的两个3′末端添加突出的1个脱氧胸腺嘧啶核苷或尿嘧啶核苷残基从而得到[1]中记载的载体的步骤。[11]一种试剂盒，其为克隆用试剂盒，含有[1]至[6]中任意一项所述的载体以及DNA连接酶。专利技术效果根据本专利技术，可以提供这样一种载体，通过简单操作即能够仅选择出沿期望方向插入有目的基因的克隆。另外，根据本专利技术，在对含有插入有目的基因的质粒的转化体进行鉴定时，不需要X-Gal或IPTG等，从而简化了准备操作。此外，本专利技术的载体也在对富含AT的DNA片段进行的克隆中发挥作用。附图说明图1为示出实施例2(1)中经过使用了本专利技术载体的TA克隆而得到的转化体的菌落PCR结果的图。图2为示出实施例2(1)中经本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
2010.09.03 JP 2010-197380;2010.12.24 JP 2010-286831.一种载体，其为由直链状双链DNA形成的克隆用载体，所述直链状双链DNA在两个3′末端具有突出的1个脱氧胸腺嘧啶核苷或尿嘧啶核苷残基，该载体的特征在于，其保持有对β-内酰胺酶基因的部分序列进行编码的核酸，所述核酸为缺失了这样的核酸序列的活性丧失β-内酰胺酶基因，该核酸序列对在所述β-内酰胺酶的耐药性发挥中不可缺少的C末端的1个氨基酸进行编码，所述活性丧失β-内酰胺酶基因配置在所述双链DNA载体的3′末端的任一者上，5′-GGTAA-3′、5′-TTTAA-3′或5′-TCTAA-3′核酸序列配置在插入DNA片段的任一者的5′末端，使得在将所述插入DNA片段连接到该载体时，构成了对使所述活性丧失β-内酰胺酶基因发挥耐药性的苯丙氨酸或色氨酸进行编码的核酸，其中，所述载体使得只通过对耐药性进行选择而得到沿期望方向插入了核酸片段的克隆。2.权利要求1所述的载体，其中，所述活性丧失β-内酰胺酶基因由对序列表的序列号17中记载的氨基酸序列进行编码的核酸序列形成。3.权利要求1所述的载体，还包括第2耐药性基因，所述第2耐药性基因示出对与氨苄西林不同的药剂的耐药性。4.一种载体，其为权利要求1所述的载体，其由由序列表的序列号5中记载的核酸序列形成的正链DNA以及由序列表的序列号18中记载的核酸序列形成的负链DNA形成。5.一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：棚濑智雄，
申请(专利权)人：宝生物工程株式会社，
类型：发明
国别省市：