小鼠肝脏羧酸酯酶基因克隆表达制造技术

一种小鼠肝脏羧酸酯酶基因克隆表达，属于分子生物学技术领域，其表达是：以小鼠肝脏总RNA为模板，通过RT-PCR技术扩增了末端含有EcoRI和XhoI酶切位点的DNA片段，对其进行了亚克隆及测序，用软件VectorNTI对所测定序列与对应的NCBI序列进行比对分析，确定该基因为Mces1f。通过EcoRI和XhoI进行双酶切，使Mces1f基因经T4DNA连接酶作用连接在大肠杆菌高效表达载体酶切位点上构建重组质粒PET-32a-Mces1f。有益效果是：利用本发明专利技术构建的工程菌及其产生的重组酶降解环境中的农药残留物，改善环境，它与其他的降解方法相比酶制作方法简单，生产成本低且降解效率高。

【技术实现步骤摘要】
小鼠肝脏羧酸酯酶基因克隆表达
本专利技术属于分子生物学

技术介绍
羧酸酯酶(Carboxylesterase, EC 3. I. I. I)属于B-酯酶,能够催化水解含羧酸酯基的脂肪族和芳烃类有机化合物。羧酸酯酶在生物界分布极广，从古细菌和真细菌、至真核微生物、昆虫乃至哺乳动物的各种组织均有活性较高的羧酸酯酶，尤其肝脏中的酶活性最高。羧酸酯酶可以催化酯水解、酯合成、酯交换等具有重要应用价值的反应，由于羧酸酯酶在食品、染料、皮革、纸张等工业中有多样的应用，因此羧酸酯酶在生物
扮演着极其重要的角色。此外还被应用于制药、染料、杀虫剂和杀菌剂等工农业废水中含羧酸酯基类毒性污染物的降解。目前已经从人、微生物及昆虫中克隆到羧酸酯酶基因，其中从无色杆菌 (Achromobacter pichaudii)得到259aa的酶,其最高酶活为O. 7U/ml ;从嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geabacillusstearotheromphilus)得到 29KDa 的酶，其最高酶活为 700U/ml ;从嗜热圆锥网团菌(Dictyoglomus turgidum)得到45KDa的酶,其最高酶活为80U/mg ;从棉铃虫(Helicoverpa armigera)得到IOOKDa的酶，其最高酶活为O. 32mmol/100ul ;从抗性蚊虫(Culex quinquefasciatus)得到60KDa的酶，其最高酶活为135U/mg。此外从斜纹夜蛾(Spodoptera litura)、铅青链霉菌(Deduc Streptomyces lividans)、野山香(Bombyx momdarina M)、铜绿妮(Lucilia cuprina)、稻褐飞風(Nilaparvata lugens)、大鼠(rat)以及人胎脑等来源均克隆得到相应的羧酸酯酶。然而，至今从小鼠肝脏中克隆获得的羧酸酯酶报道很少，国外对其的研究应用还很少(13篇研究论文，NCBI PUBMID数据库检索)，国内至今未见研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种小鼠肝脏羧酸酯酶基因克隆表达，它运用基因克隆技术，成功克隆到小鼠肝脏羧酸酯酶(Mceslf )基因，与表达载体PET_32a连接后在大肠杆菌 BL21中进行了该基因的高效表达。而小鼠肝脏羧酸酯酶(Mceslf)基因对呋喃丹、西维因、 甲基对硫磷、联苯菊酯等农药有降解作用。本专利技术的表达是I.以小鼠肝脏总RNA为模板，通过RT-PCR技术扩增了末端含有EcoR I和Xho I酶切位点的DNA片段，对其进行了亚克隆及测序，用软件Vector NTI对所测定序列与对应的NCBI 序列(GenBank BC013479. I)进行比对分析，确定该基因为Mceslf。—pt EcoR I起始密码子 GMHEATGTTCCTTAGCACTCTGTTCCTGGTGTCTCTAGCAACCTGTGTGATTTGCGGAAATCCCTCTTCACCACCTGTGGTAGACACTGCTCATGGTAAAGTCCTGGGGAAACACGTGAACGTAGAAGGATTTTCACAGCCTGTGGCCGTCTTCCTGGGAATCCCCTTTGCCAAGCCCCCTCTTGGATCCCTGAGGTTTGCTCCACCACAGCCTGCAGAGCCCTGGAGCTCAGTGAAGAATGCCACCACCTACCCACCTATGTGCTCCCAAGATGCAGCTAGAGGACAGGCGGTCAATGACCTCATAACCAATAGAAAGGAGAAAATCCATCTTGAATTTTCTGAAGATTGCCTGTACCTAAATATTTACACTCCTGCGGACTTTTCAAAGAACAGTAGGCTACCGGTGATGGTGTGGATCCATGGAGGTGGACTGAAGCTGGGTGGGGCATCAAGCTTTGATGGACGGGCTCTCTCTGCATACGAAAATGTGGTGGTGGTGGCCATTCAATATCGCCTGAGTATCTGGGGATTCTTCAGCACAGGGGATGAACACAGTCGGGGAAACTGGGGTCATTTGGACCAAGTGGCTGCTCTGCATTGGGTCCAGGACAACATTGCCAACTTTGGCGGGGACCCAGGCTCTGTGACCATCTTTGGAGAGTCAGCAGGAGGTTACAGTGTCTCAATTCTTATATTGTCCCCATTGTCCAAGAACCTCTTCCACAGTGCCATTTCTGAGAGTGGTGTGGCCTTCATTCCTGGAATGTTTACCAAAGATGTGAGGCCAATTACTGAGCAAATTGCTGTTACTGCTGGCTGTAAGACCACCACGTCTGCCGTCATTGTTCACTGCATGCGCCAGAAGACGGAGGAGGAGCTATTAGAGATCATGCATAAATTGAATCTGTATAAACTGAGTTTACAAGGAGATACCAAAAATAGCGACCAGTTCGTGACAAGTGTGCTTGATGGAGTGGTGCTACCAAAGGACCCCAAAGAGATCCTGGCTGAGAAGAACTTCAACACTGTGCCTTACATTGTGGGAATCAACAAGCAAGAATGTGGCTGGCTTCTGCCAACAATGACGGGATTTCTACCAGCTGATGTAAAATTGGACAAGAAGAAAGCCATTGCACTCCTGGAGCAATTTGCTTCCATGACTGGCATACCAGAGGATATTATTCCAGTTGCTGTTGAGAAGTACACAAAAGGTAGTGATGACCCTGATCAGATCAGAGAGGGAGTTCTCGACGCAATGGGGGATGTGGCATTTGGTGTTCCATCGGTGATTGTGTCCCGTGGCCACAGAGACACTGGAGCTCCCACCTACATGTATGAGTATCAATACTACCCAAGCTTCTCATCACCCCAAAGACCCAAGAATGTAGTAGGAGACCATGCAGATGATGTCTACTCTGTCTTCGGTGCTCCAATTTTAAGAGAGGGTGCCTCCGAAGAGGAGATCAATCTCAGCAAGATGGTGATGAAATCCTGGGCCAACTTTGCTCGGAATGGGAACCCTAATGGCAAAGGGCTGCCTCATTGGCCAAAGTATGATCAGAAAGAAGGATATCTTCATATTGGTGGCACCACCCAGCAAGCCCAGTGACTGAAGGAGGAGGAAGTGACTTTCTGGACACAGTCCCTTGCCAAGAAACAACCCCAGCCATACCACAATGAGCTGTGACTtK^2.通过EcoR I 和 Xho I 进行双酶切(double digestion),使 Mceslf 基因经 T4 DNA 连接酶(T4 DNA Iigase)作用连接在大肠杆菌高效表达载体PET-32a的EcoR I和Xho I 酶切位点上构建重组质粒PET-32a-Mc本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小鼠肝脏羧酸酯酶基因克隆表达，其表达是：（1）.以小鼠肝脏总RNA为模板，通过RT？PCR技术扩增了末端含有EcoR？I和Xho？I酶切位点的DNA片段，对其进行了亚克隆及测序，用软件Vector？NTI对所测定序列与对应的NCBI序列进行比对分析，确定该基因为Mces1f；EcoR？I？起始密码子GAATTCATGTTCCTTAGCACTCTGTTCCTGGTGTCTCTAGCAACCTGTGTGATTTGCGGAAATCCCTCTTCACCACCTGTGGTAGACACTGCTCATGGTAAAGTCCTGGGGAAACACGTGAACGTAGAAGGATTTTCACAGCCTGTGGCCGTCTTCCTGGGAATCCCCTTTGCCAAGCCCCCTCTTGGATCCCTGAGGTTTGCTCCACCACAGCCTGCAGAGCCCTGGAGCTCAGTGAAGAATGCCACCACCTACCCACCTATGTGCTCCCAAGATGCAGCTAGAGGACAGGCGGTCAATGACCTCATAACCAATAGAAAGGAGAAAATCCATCTTGAATTTTCTGAAGATTGCCTGTACCTAAATATTTACACTCCTGCGGACTTTTCAAAGAACAGTAGGCTACCGGTGATGGTGTGGATCCATGGAGGTGGACTGAAGCTGGGTGGGGCATCAAGCTTTGATGGACGGGCTCTCTCTGCATACGAAAATGTGGTGGTGGTGGCCATTCAATATCGCCTGAGTATCTGGGGATTCTTCAGCACAGGGGATGAACACAGTCGGGGAAACTGGGGTCATTTGGACCAAGTGGCTGCTCTGCATTGGGTCCAGGACAACATTGCCAACTTTGGCGGGGACCCAGGCTCTGTGACCATCTTTGGAGAGTCAGCAGGAGGTTACAGTGTCTCAATTCTTATATTGTCCCCATTGTCCAAGAACCTCTTCCACAGTGCCATTTCTGAGAGTGGTGTGGCCTTCATTCCTGGAATGTTTACCAAAGATGTGAGGCCAATTACTGAGCAAATTGCTGTTACTGCTGGCTGTAAGACCACCACGTCTGCCGTCATTGTTCACTGCATGCGCCAGAAGACGGAGGAGGAGCTATTAGAGATCATGCATAAATTGAATCTGTATAAACTGAGTTTACAAGGAGATACCAAAAATAGCGACCAGTTCGTGACAAGTGTGCTTGATGGAGTGGTGCTACCAAAGGACCCCAAAGAGATCCTGGCTGAGAAGAACTTCAACACTGTGCCTTACATTGTGGGAATCAACAAGCAAGAATGTGGCTGGCTTCTGCCAACAATGACGGGATTTCTACCAGCTGATGTAAAATTGGACAAGAAGAAAGCCATTGCACTCCTGGAGCAATTTGCTTCCATGACTGGCATACCAGAGGATATTATTCCAGTTGCTGTTGAGAAGTACACAAAAGGTAGTGATGACCCTGATCAGATCAGAGAGGGAGTTCTCGACGCAATGGGGGATGTGGCATTTGGTGTTCCATCGGTGATTGTGTCCCGTGGCCACAGAGACACTGGAGCTCCCACCTACATGTATGAGTATCAATACTACCCAAGCTTCTCATCACCCCAAAGACCCAAGAATGTAGTAGGAGACCATGCAGATGATGTCTACTCTGTCTTCGGTGCTCCAATTTTAAGAGAGGGTGCCTCCGAAGAGGAGATCAATCTCAGCAAGATGGTGATGAAATCCTGGGCCAACTTTGCTCGGAATGGGAACCCTAATGGCAAAGGGCTGCCTCATTGGCCAAAGTATGATCAGAAAGAAGGATATCTTCATATTGGTGGCACCACCCAGCAAGCCCAGTGACTGAAGGAGGAGGAAGTGACTTTCTGGACACAGTCCCTTGCCAAGAAACAACCCCAGCCATACCACAATGAGCTGTGACTCGAG？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？终止密码子...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：于源华，周帅，乔玉龙，王保学，张昊，姚健，王岩，王维，邬磊，
申请(专利权)人：长春长理康源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：