本发明专利技术涉及一种深海来源羧酸酯酶DMWf18‑558及其编码基因与应用。羧酸酯酶DMWf18‑558编码基因由宏基因组筛选获得，其核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。将此羧酸酯酶基因异源表达后，在底物为对硝基苯酚己酸酯(C6)时催化活性最高，酶活可达367U/mg。羧酸酯酶DMWf18‑558催化水解温度范围为15～40℃，优选为15～35℃；催化水解pH值为3.0～10.0，优选为6.5～9.0；催化水解NaCl浓度在0.5～3M，优选为0.5‑1M。该酯酶可广泛应用于油脂水解、药物合成代谢、食品加工、废水处理、洗涤工业等领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种深海沉积物来源羧酸酯酶、其编码基因及其应用。
技术介绍
脂类水解酶包括羧酸酯酶(EC3.1.1.1)和脂肪酶(EC3.1.1.3)，广泛存在于微生物中，能够催化酯类化合物的水解和合成。羧酸酯酶主要催化少于10个碳的短链酰基甘油，脂肪酶主要催化大于10个碳的长链酰基甘油。脂类水解酶具有许多优良特性，如催化反应不需要辅助因子，手型选择特异性高，拥有较广的底物谱，以及在有机溶剂中保持高稳定性等。脂类水解酶是工业生产中重要的催化剂，可广泛应用于手性药物催化、皮革绢纺原料脱脂、废水处理、洗涤工业以及食品加工等方面。目前已经有许多微生物来源的脂肪酶得到了商业化生产，并在生产生活的各个方面得到应用。而羧酸酯酶作为一种重要的工业用酶，在实际生产中得到应用的种类和数量还十分有限。新型羧酸酯酶资源的挖掘和积累是满足食品和化工等工业对羧酸酯酶日益增长需求的必要条件。本专利技术运用宏基因组构建和羧酸酯酶活性筛选的技术，获得深海来源新型羧酸酯酶，并研究其酶学性质。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的深海来源羧酸酯酶、其编码基因及其制备方法，该羧酸酯酶可用于酯类降解及其他酯类化合物的生物催化和转化。本专利技术从太平洋海山深海沉积物宏基因组文库中，以三丁酸甘油酯作为底物筛选羧酸酯酶活性，获得一种新的羧酸酯酶DMWf18-558，其编码基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。将该羧酸酯酶序列在GenBank中进行同源搜索，与之相似性最高的也是宏基因组来源的酯酶，相似性为82％(其在GenBank数据库中的注册号为AFB82690)。系统发育分析结果表明，羧酸酯酶DMWf18-558属于脂类水解酶家族中的第IV家族。根据氨基酸序列推测，羧酸酯酶DMWf18-558的催化中心由丝氨酸、谷氨酸和组氨酸(氨基酸位置为144、238和268)组成，其中丝氨酸位于甘氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸和甘氨酸(氨基酸位置为142至146)组成的保守序列中，因此羧酸酯酶DMWf18-558属于第IV家族GDSAG亚家族。氧离子洞位于75和76位两个甘氨酸。综上所述，DMWf18-558应为脂类水解酶第IV家族中的一名新成员。在不影响酯酶DMWf18-558蛋白活性前提下，可对SEQIDNO:2所示的远离催化中心氨基酸位置(优选142-146、238和268氨基酸位置)的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有酯酶DMWf18-558活性的衍生蛋白质。根据本领域技术的公知常识，蛋白质的生物学活性是和其功能结构域密切相关的。一般来说，只有发生在功能结构域的位点突变可能对蛋白质的二维和三维结构产生影响，从而影响其生物学活性。而对于发生在远离功能结构域(优选远离142-146、238和268位氨基酸位置)的氨基酸位点，由于这一区域不参与蛋白功能构象，因而氨基酸的个别点突变不会对蛋白质的生物学活性产生实质性影响，从而能够基本保留原蛋白质的生物学功能。所述的能够基本保留原蛋白质的生物学功能是指衍生蛋白质具有80％以上的酯酶DMWf18-558的生物学活性，优选具有90％以上的酯酶DMWf18-558的生物学活性，更优选具有95％以上的酯酶DMWf18-558的生物学活性。优选的酯酶DMWf18-558突变体具有至少与SEQIDNO:2所示的氨基酸序列90％以上的同源性，更优选具有至少95％以上的同源性，最优选具有至少99％以上的同源性。同理，本专利技术还提供了编码如SEQIDNO.2所示氨基酸序列的基因序列，其与SEQIDNO.1所示的核苷酸序列一致；本专利技术还提供对SEQIDNO.1所示的核苷酸序列中除424-438、712-714和802-804位核苷酸外的其他核苷酸进行替换、添加和/或缺失一个或几个核苷酸从而获得编码能基本保留酯酶DMWf18-558蛋白生物学活性的突变体基因。优选的酯酶DMWf18-558突变体基因具有至少与SEQIDNO:1所示的核苷酸序列90％以上的同源性，更优选具有至少95％以上的同源性，最优选具有至少99％以上的同源性。利用基因克隆技术，可将克隆到的酯酶DMWf18-558基因连接到合适的载体上，并转化或转染到原核生物或真核生物宿主表达制备重组酯酶DMWf18-558。合适的原核生物宿主包括各种细菌如E.coli等，合适的真核生物宿主包括酵母(如甲醇酵母)及哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞)等，优选采用原核表达系统E.coli。合适的载体为本领域技术人员所熟知的各种可商业化购买的原核或真核表达载体，原核表达载体如pET系列载体，pQE系列载体；酵母表达载体pPICZ-α-A，pHIL-D2，pPIC9，pHIL-S1(InvitrogenCorp.SanDiego.California.USA)；动物细胞表达载体pSVK3、pMSG(AmershamPharmaciaBiotechInc.USA)等。一个优选的例子是将本专利技术筛选到羧酸酯酶DMWf18-558的编码基因连接到大肠杆菌表达载体pET28a(Novagen)上，并转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中，经诱导表达出高活性的重组酯酶。本专利技术还提供了羧酸酯酶DMWf18-558或能表达羧酸酯酶DMWf18-558的宿主菌在工业上的应用，例如可用于催化酯类水解。通过酯酶活力测定表明，羧酸酯酶DMWf18-558或上述能表达羧酸酯酶DMWf18-558的宿主菌可用于水解短链脂肪酸酯，例如C2-C8短碳链脂肪酸酯。优选的短链脂肪酸酯为具有C2-C8短碳链的对硝基苯酚酯，例如对硝基苯酚乙酸酯、对硝基苯酚丁酸酯、对硝基苯酚己酸酯或对硝基苯酚辛酸酯等，其中底物为对硝基苯酚己酸酯(C6)时催化活性最高，酶活达367U/mg。羧酸酯酶DMWf18-558催化水解温度范围为15～40℃，优选为15～35℃；所述水解的pH值为3.0～10.0，优选为6.5～9.0。在20℃以下保温1h，可保持70％以上的残余酶活；在30℃中保温1h，可保持50％以上的残余酶活。本专利技术提供的新型羧酸酯酶及其编码基因在医药制备、食品加工及风味改良、废水处理、洗涤行业具有重要的应用潜力。附图说明图1为纯化羧酸酯酶DMWf18-558的聚乙酰胺凝胶电泳分析图。图2为羧酸酯酶DMWf18-558的底物特异性图。C2：对硝基苯酚乙酸酯；C4：对硝基苯酚丁酸酯、C6：对硝基苯酚己酸酯；C8：对硝基苯酚辛酸酯；C10：对硝基苯酚癸酸酯；C12：对硝基苯酚十二酸酯；C14：对硝基苯酚十四酸酯；C16：对硝基苯酚十六酸酯；定义底物为C6时测定值为100％。图3为羧酸酯酶DMWf18-558最适反应温度图。图4为羧酸酯酶DMWf18-558最适反应pH图。图5为羧酸酯酶DMWf18-558最适反应NaCl浓度图。图6为二价阳离子对羧酸酯酶DMWf18-558活性影响图。图7为有机溶剂和去垢剂对羧酸酯酶DMWf18-558活性影响图。图8为羧酸酯酶DMWf18-558的温度稳定性图。具体实施方式实施例1羧酸酯酶DMWf18-558编码基因的获取深海沉积物样品由深海可视多管取样器采集自太平洋海山边缘。宏基因组文库构建采用Copy本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种羧酸酯酶，是具有如下(1)或(2)特征的蛋白质：(1)、其氨基酸序列与Seq ID NO.2所示序列一致；(2)、对SEQ ID NO.2所示的远离142‑146、238和268氨基酸位置的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸后获得能够基本保留原蛋白质生物学功能的衍生蛋白质。
【技术特征摘要】
1.一种羧酸酯酶，是具有如下(1)或(2)特征的蛋白质：(1)、其氨基酸序列与SeqIDNO.2所示序列一致；(2)、对SEQIDNO.2所示的远离142-146、238和268氨基酸位置的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸后获得能够基本保留原蛋白质生物学功能的衍生蛋白质。2.根据权利要求1所述的羧酸酯酶，其特征在于：所述的具有羧酸酯酶活性的衍生蛋白质具有至少与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列90％以上的同源性。3.编码权利要求1所述羧酸酯酶的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；或为对SEQIDNO.1所示的核苷酸序列中除424-438、712-714和802-804位核苷酸外的其他核苷酸进行替换、添加和/或缺失一个或几个核苷酸从而获得编码能基本保留羧酸酯酶蛋白生物...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘倩，许学伟，霍颖异，崔恒林，王春生，
申请(专利权)人：国家海洋局第二海洋研究所，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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