一类检测羧酸酯酶1的高特异性荧光探针的应用制造技术

一类检测羧酸酯酶1（Carboxylesterase 1，CE1）的高特异性荧光探针的应用，其属于精细化工领域。该特异性探针底物是2‑羟基‑3‑烯丙基苯并噁唑类化合物酯类衍生物，其可用于检测不同生物样品中CE1的存在与否及其活力的定量测定。酶活具体测定流程如下：选择2‑羟基‑3‑烯丙基苯并噁唑酯类衍生物水解反应为探针反应，选择适宜底物浓度在线性反应区间内通过定量检测单位时间内其水解代谢产物2‑羟基‑3‑烯丙基苯并噁唑的生成量来测定各生物样品、细胞、在体及整体器官中CE1酶的实际活性。该探针不仅可用于不同来源生物样本中CE1酶活的定量评估，此外借助该探针反应还可用于体外快速筛选CE1的抑制剂。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一类检测羧酸酯酶1(Carboxylesterase1，CE1)的高特异性荧光探针的应用，其属于精细化工领域。
技术介绍
羧酸酯酶1(carboxylesterase1，CE1)，是一种广谱性丝氨酸蛋白酶，参与很多药物与有毒物质的代谢，并参与一些其他的生理过程。CE1主要在肝中表达，在小肠、肾、肺、睾丸、心脏中有少量分布，CE1与羧酸酯酶2(carboxylesterase2；CE2)，具有47％序列同源性，但其组织分布以及偏好底物结构特征明显异于CE2。CE1催化三角包括Ser-221,Glu-353,以及His-467，涉及两步反应机理。第一步，在丝氨酸残基作用下形成一个共价的乙酰-酶中间体，同时释放出含有醇羟基部分产物。第二步，一分子水进攻乙酰-酶中间体，同时释放出羧基部分产物。如果是其他化合物进攻乙酰-酶中间体，将发生酰基转移反应，而不是水解反应。CE1的主要功能是异生物质代谢，它能水解含有羧酸酯键、酰胺键、硫酯键等结构的化合物。并且，CE1能代谢一些临床药物，包括可卡因、吗啡、哌替啶、杜冷丁以及利多卡因。此外，CE1能将一些前药分子，比如洛伐他汀水解为其在体内具有活性的形式。CE1将R-可卡因中甲酯键连接部分水解，生成苯甲酰爱康宁(尿中能检测到的可卡因的主要代谢产物)。当可卡因与乙醇同时存在的时候，CE1能代谢可卡因生成有毒物质可卡因乙碱。CE1的第二大生物功能是在代谢及运输肝脏及其周边的胆固醇以及脂肪酸过程中发挥重要作用。虽然有一些其他的酶参与这些过程，但是研究者发现，在单核细胞，巨噬细胞以及肝细胞中，CE1具有非胆-盐依赖性，也被称为胆固醇水解酶(cholesterylesterhydrolase，CEH)，胆固醇从血管壁转运至肝脏的过程被称为―巨噬细胞反向胆固醇运输”，是复原动脉粥样硬化损伤的过程，而CHE催化的胆固醇酯的水解，是调节胆固醇转移出巨噬细胞过程的限速步骤。此外，CE1具有脂肪乙酰辅酶A水解功能，CE1催化脂肪酰辅酶A和乙醇生成的脂肪酰乙酯(FAEEs)与酗酒者肝脏坏死性损伤息息相关。CE1的第三大生物功能是在内质网中被N联糖基化位点修饰后，具有交换和保留蛋白功能。在内质网中，CE1直接与C-反应蛋白结合(C-reactiveprotein，CRP)，直至CRP释放到血液中。CRP的释放与组织损伤相关，迄今为止，它是最灵敏的检测动脉粥样硬化的标志物。此外，CE1同样与内质网中的II相药物代谢酶β-葡萄糖醛酸酶结合，β-葡萄糖醛酸酶用于清除异性生物质、内源性物质，如有机磷酸酯类的化合物外的外排与之相关。此外，CE1可作为早期肝癌肿瘤标志物。Na等通过对58例肝癌患者的肝组织样本进行研究发现，与正常肝组织相比，肝癌组织中CE1表达量明显降低，表明肝癌细胞的生长可能会抑制CE1的表达。最近还发现肝癌患者血清中CE1的含量明显升高，CE1可能成为一种潜在的肝癌早期诊断的血清标志物，对CE1的检测具有重要意义。本专利技术提供了一类2-羟基-3-烯丙基苯并噁唑类化合物的酯类衍生物及其作为CE1酶荧光探针底物的应用，其经羧酸酯酶CE1水解后可生成荧光发射波谱不同于原型的水解产物。该酶促反应具有选择性高、代谢产物易检测、酶活及抑制活性评价快速高效等特点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一类检测羧酸酯酶1(CE1)的高特异性荧光探针及其应用，该底物原型和水解产物的荧光荧光属性具有明显差异。利用该探针反应可对多种生物体系中CE1的分布和功能进行定量评价。本专利技术的目的在于提供一类检测羧酸酯酶1(CE1)的高特异性荧光探针及其应用，该底物的酯键在人源组织或细胞中可被CE1特异性水解为相应水解产物，且产物具有荧光；该底物是以2-羟基-3-烯丙基苯并噁唑类化合物为原料，通过酯化反应获得相应2-羟基酯类衍生物，其结构通式如式(1)所示，其中，R为甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、苯基、对甲基苯基、对乙基苯基、对丙基苯基、对己基丙基、对硝基苯基、对氯苯基、1-奈基、2-呋喃基、2-噻吩基、(4-苯基)苯基、4-乙氧基苯基取代基中的一种。如当R为正丙基时，该底物为2-丁酰氧基3-烯丙基苯并噁唑。本专利技术还提供了CE1的特异性荧光探针底物的应用，该底物作为CE1的特异性底物，发生水解反应，通过定量检测单位时间内水解产物的生成量来测定酶或细胞制备液等生物样品及细胞中CE1的活性；具体测定方法为：——体系中以2-羟基-3-烯丙基苯并噁唑类化合物2-羟基的酯类衍生物作为特异性探针底物；底物浓度选择1/10～10Km；单点测定时底物浓度优选Km。——在PBS或Tris-HCl等常用缓冲液中，反应温度为20℃至60℃之间，优选37℃为最优反应时间；孵育体系pH介于5.5～10.5之间，优选pH7.4为最优反应pH值；——反应时间为5～120分钟，在确保以上底物相应的水解产物达到定量限且底物转化率不超过20％时终止反应；——测定单位时间内水解产物生成量作为羧酸酯酶CE1活性的评价指标。本专利技术提供的人羧酸酯酶1特异性荧光探针底物的应用，所述底物消除率或水解产物的生成率应介于0.1％～20％之间。本专利技术提供的人羧酸酯酶1特异性荧光探针底物的应用，探针底物及其水解产物均具有荧光属性，可采用荧光检测器实现产物及底物的快速灵敏检测；荧光检测条件为：激发波长330nm，在450～600nm进行荧光发射谱的检测。此外，该特异性探针底物及相应CE1活性检测过程不会受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种生物体系中CE1酶活的定量测定。该特异性探针反应可用于重组羧酸酯酶、人及动物组织制备液及各类组织细胞中CE1酶活的定量测定，还可用于快速筛选CE1酶的抑制剂及抑制能力的定量评价。采用重组羧酸酯酶CE1单酶，肝微粒体孵育体系进行考察，通过相关性分析，特异性抑制实验，重组单酶代谢反应，以及酶反应动力学等多方面的证据，证明2-羟基-3-烯丙基苯并噁唑类化合物2-羟基的酯类衍生物可特异性的经羧酸酯酶CE1代谢，生成相应的水解产物。作为高特异性的羧酸酯酶CE1的荧光探针底物，该化合物可以用来检测羧酸酯酶CE1的活性，尤其适合用于对细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌克隆表达体系生产的羧酸酯酶CE1重组酶的酶活测定，以及多种哺乳动物组织器官来源的组织微粒体、S-9等制备物中CE1的活性标定。选用本专利技术所述羧酸酯酶CE1的特异性探针底物检测羧酸酯酶CE1酶体外活性具有以下突出优势：(1)高特异性：2-羟基-3-烯丙基苯并噁唑类化合物2-羟基的酯类衍生物可被羧酸酯酶CE1高特异性地代谢成一个代谢产物，即2位酯键断裂的水解产物。(2)廉价易得：2-羟基-3-烯丙基苯并噁唑类化合物2-羟基的酯类衍生物及其水解产物均可经化学合成获得，合成工艺简单易行。(3)高灵敏度：具有2-羟基-3-烯丙基苯并噁唑母核结构的化合物均具有良好的荧光发射光谱特性(450～600nm)，该底物及其水解代谢产物具有不同的荧光发射光谱特征，能较好的进行区分检测，同时可通过绘制标准曲线进行定量测定。附图说明图1单酶选择性。图中数字分别代表如下(1：碳酸苷酶、2：胃蛋白酶、3：胰蛋白酶、4：脂肪酶、5：a-糜蛋白酶(a-CT)6：蛋白酶K、7：视黄醇结合蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
一类检测羧酸酯酶1(CE1)的高特异性荧光探针的应用，其特征在于：该探针的酯键可被CE1特异性水解为相应水解产物并产生产物对应的荧光；该探针作为CE1的特异性底物，利用其水解反应活性，通过定量检测单位时间内水解产物的生成量来测定不同酶源中CE1的活性；式（1）该探针为2‑羟基‑3‑烯丙基苯并噁唑酯类衍生物，其结构通式如式（1）所示，其中R为甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、苯基、对甲基苯基、对乙基苯基、对丙基苯基、对己基丙基、对硝基苯基、对氯苯基、1‑萘基、2‑呋喃基、2‑噻吩基、（4‑苯基）苯基、4‑乙氧基苯基取代基中的一种。

【技术特征摘要】
1.一类检测羧酸酯酶1(CE1)的高特异性荧光探针的应用，其特征在于：该探针的酯键可被CE1特异性水解为相应水解产物并产生产物对应的荧光；该探针作为CE1的特异性底物，利用其水解反应活性，通过定量检测单位时间内水解产物的生成量来测定不同酶源中CE1的活性；式（1）该探针为2-羟基-3-烯丙基苯并噁唑酯类衍生物，其结构通式如式（1）所示，其中R为甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、苯基、对甲基苯基、对乙基苯基、对丙基苯基、对己基丙基、对硝基苯基、对氯苯基、1-萘基、2-呋喃基、2-噻吩基、（4-苯基）苯基、4-乙氧基苯基取代基中的一种。2.根据权利要求1所述的一类检测羧酸酯酶1的高特异性荧光探针的应用，其特征在于：所述酶源为重组表达的CE1单酶、人或动物组织制备液、或各类组...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔京南，冯磊，王铮，
申请(专利权)人：苏州尚稷电子科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32